--細(xì) 胞 基 本 信 息---

細(xì)胞名稱： C2C12(小鼠成肌細(xì)胞)

細(xì)胞別稱： C2c12; C2-C12; C12

細(xì)胞貨號(hào)： SNL-204

生長(zhǎng)特性: 貼壁

培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S

培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,，95%,； 二氧化碳 (CO2)，5%,；37℃

細(xì)胞簡(jiǎn)介: C2C12細(xì)胞是由D·Yaffe和O·Saxel建立的小鼠成肌細(xì)胞株的亞克隆,。C2C12細(xì)胞分化很快，形成可伸縮的肌管并生成特征性的肌蛋白,。用骨形成蛋白2(BMP-2)處理C2C12細(xì)胞,，會(huì)導(dǎo)致C2C12細(xì)胞的分化途徑從成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)換為成骨細(xì)胞。檢測(cè)表明,，C2C12細(xì)胞鼠痘病毒陰性,。C2C12細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng)，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主,。

細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)照片

C2C12細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)：

1. 細(xì)胞貼壁較弱

該細(xì)胞貼壁比較弱,，消化時(shí)間偏短，注意控制消化時(shí)間,。另外,，在遇到運(yùn)輸震蕩、低溫,、室溫靜置太長(zhǎng)時(shí)間,、添加的培養(yǎng)基或其他試劑過冷等情況時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯的細(xì)胞回縮變粗變短甚至脫落的現(xiàn)象，及時(shí)放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)后可恢復(fù)正常,。

2. 注意控制細(xì)胞密度

密度過高和過低都會(huì)影響細(xì)胞狀態(tài),。密度過低時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度減慢,；長(zhǎng)滿后長(zhǎng)時(shí)間高密度培養(yǎng)將導(dǎo)致細(xì)胞受損,，可能影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。建議細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)立即傳代,。

3. 細(xì)胞生長(zhǎng)較快

注意每天觀察細(xì)胞密度和培養(yǎng)基顏色,，及時(shí)換液或傳代,。應(yīng)注意每天傳代對(duì)細(xì)胞不利，通過控制接種密度將傳代頻率保持在2天左右傳一次為宜,。

4. 培養(yǎng)時(shí)背景中可能有黑點(diǎn)

背景中存在少量黑點(diǎn)，為細(xì)胞代謝產(chǎn)物和細(xì)胞碎片,，不影響細(xì)胞生長(zhǎng),。若碎片較多可以通過PBS潤(rùn)洗或換液清除。

C2C12細(xì)胞傳代攻略

1. 準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、胰酶,、PBS、離心管,、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等,；（試劑提前預(yù)熱）

2. 先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基，再加5mL 常溫PBS輕輕潤(rùn)洗細(xì)胞10-20s,，吸走潤(rùn)洗的PBS,；

3. T25瓶加1mL胰酶，輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細(xì)胞層,，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化,；

4. 消化到細(xì)胞明顯回縮，間隙變大,，但未完*脫落時(shí)加2-3mL完*培養(yǎng)基終止胰酶消化,；

Tips：

1. 如果您無法準(zhǔn)確掌控胰酶作用時(shí)間，建議按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細(xì)胞,，放入37度培養(yǎng)箱,，然后每隔30秒，即吹打1-2次細(xì)胞（此時(shí)吹打細(xì)胞應(yīng)盡量輕柔,，不能強(qiáng)行將細(xì)胞吹下,，否則細(xì)胞將出現(xiàn)機(jī)械損傷），如果細(xì)胞被輕易吹下,，說明細(xì)胞消化完成可以終止消化,，如果30秒吹打不下，再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細(xì)胞,；細(xì)胞貼壁較弱,，所以消化時(shí)間會(huì)比常規(guī)貼壁細(xì)胞短很多，注意控制消化時(shí)間,；

5. 混勻細(xì)胞并轉(zhuǎn)移至離心管中,，1000rpm離心3min；

6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基,；（T25推薦10mL,，T75推薦20mL）

7. 離心完成后,，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣,；

Tips：

1. 推薦傳代比例1：2，細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)立即傳代,。

2. 建議傳代后24h再觀察細(xì)胞,，若有漂浮死細(xì)胞，可通過換液去除

C2C12細(xì)胞凍存攻略

1. 配制程序性凍存液,，準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記,。

Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO

2. 先將細(xì)胞按傳代步驟獲得細(xì)胞沉淀；

3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細(xì)胞,，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中,；

4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜,；

5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置,。

Tips：

l 液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性，若活性合格即可長(zhǎng)期保存,。

l 程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,，若使用非程序凍存液請(qǐng)按產(chǎn)品說明書處理降溫過程。

l T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿通?？蓛龃?-3管,，10cm皿長(zhǎng)滿通常可凍存3-4管,。

l 凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳,。

C2C12細(xì)胞復(fù)蘇方法

1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速,；

2. 將細(xì)胞從液氮罐中取出，觀察管內(nèi)無液氮的情況下,，捏住管蓋,，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴,，融化過程不超過2min,；

Tips：

l 若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn)，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房,。

l 凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過程中難免滲入液氮,，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過大,。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮，若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完*蒸發(fā)后再水浴,。做好防護(hù),，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷。

l 水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,，避免污染,。

3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異

4. 離心完成后棄上清,，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱,；

5. 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況。

Tips：整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成,。

C2C12細(xì)胞收貨攻略

l 常溫細(xì)胞

1. 收貨后,，拆開外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面,，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上,；

2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,，觀察細(xì)胞密度,，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng),；

Tips：若收貨時(shí)發(fā)現(xiàn)懸浮細(xì)胞較多,，應(yīng)離心收集懸浮細(xì)胞并放回原瓶

l 凍存細(xì)胞

1. 細(xì)胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存,，若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷售人員解決,；

2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查，以免超出售后期,，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略,；

3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷售人員，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作,；

Tips：

1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液,、培養(yǎng)瓶破損、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí),，及時(shí)拍照聯(lián)系銷售人員,；

2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基，可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng),；

常見問題及解決方案

細(xì)胞密度怎么計(jì)算的,？

嚴(yán)格意義上，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量,，但在實(shí)際培養(yǎng)過程中,，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù)。因此,，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值,，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn)，但也是相當(dāng)直觀,、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式,；

NO.2培養(yǎng)過程中細(xì)胞碎片較多怎么處理？

1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光,，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,，無法清除也無法改變，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象,，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng)、營(yíng)養(yǎng)缺乏,、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,，建議使用合適的培養(yǎng)條件。

2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物,，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除,，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞,，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,，混勻細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,，棄上清,。再加5mL PBS重懸細(xì)胞，再離心后,，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿,。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時(shí)碎片比較少,，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟,；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次,。

NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久,？

每個(gè)客戶用的胰酶活力及消化步驟,、試劑都是不一樣的，不能完*規(guī)定消化時(shí)間,，以實(shí)際消化效果和客戶經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn),。 

產(chǎn)品推薦：

【SNL-204】 C2C12(小鼠成肌細(xì)胞)

【SNLM-204】C2C12細(xì)胞專用完*培養(yǎng)基