細胞基本信息
▼細胞正常生長形態(tài)照片
細胞名稱： RAW 264.7(小鼠單核巨噬細胞白血病細胞)
細胞別稱： RAW264; RAW2647; RAW264.7; RAW-264.7; Raw 264.7; Raw264.7
細胞貨號： SNL-112
生長特性： 半貼壁細胞
培養(yǎng)條件： DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境： 空氣，95%,；二氧化碳 (CO2),，5%；37℃
細胞簡介： RAW 264.7細胞是從Abelson小鼠白血病病毒（MuLV）誘導(dǎo)的腫瘤中建立的雄性小鼠巨噬細胞細胞系,，Raschke等人于1976年首*報道了該細胞系,。RAW 264.7細胞sIg-、Ia-抗原,、Thy-1.2表面抗原陰性,。RAW 264.7細胞不分泌可檢測到的病毒顆粒，XC斑點形成試驗陰性,。根據(jù)Janet W.Hartley博士在2008年發(fā)表的一項研究,，RAW 264.7細胞被證明表達生態(tài)性和多向性MuLV，并且使用XC噬斑試驗對病毒復(fù)制呈陽性,。RAW 264.7細胞可以胞飲中性紅并吞噬乳膠顆粒與酵母聚糖,，并且可以抗體依賴性地分解綿羊紅血球與腫瘤靶細胞。LPS或PPD處理2天可誘導(dǎo)RAW 264.7細胞分解紅血球,，但對腫瘤靶細胞無作用,。RAW 264.7細胞易于繁殖，DNA轉(zhuǎn)染效率高,，對RNA干擾敏感,，并支持小鼠諾如病毒的復(fù)制，可以用于3D細胞培養(yǎng),、免疫系統(tǒng)紊亂和免疫學(xué)研究,，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
RAW264.7細胞培養(yǎng)注意事項
1. 存在少量分化細胞
RAW264.7細胞形態(tài)主要為圓形,。因其對環(huán)境非常敏感，在培養(yǎng)時會出現(xiàn)少量短梭形或多角形的分化細胞,，這是正?，F(xiàn)象,。分化的細胞貼壁牢固，而未分化的細胞貼壁松散,。根據(jù)貼壁松緊差異,，可將未分化的細胞吹下，并轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)器皿中進行培養(yǎng),。
2. 對胰酶敏感
RAW264.7細胞對胰蛋白酶敏感,，接觸胰酶后將很快發(fā)生自發(fā)分化，貼壁變緊,，很難消化下來,。所以不建議用胰酶對該細胞進行傳代。（詳細傳代步驟見下文）
3. 生長較快
RAW264.7細胞生長速度較快,，建議每天觀察細胞密度,，當(dāng)細胞密度到達80%時及時進行傳代，以防細胞過度生長狀態(tài)變差,。
RAW264.7細胞傳代方法
1.準備所需的培養(yǎng)基,、胰酶、PBS,、離心管,、培養(yǎng)瓶以及無菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）
2. 輕輕吸走培養(yǎng)上清,，留 2-3mL 培養(yǎng)基輕輕吹打細胞面吹下細胞,；
2. 將細胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，900rpm 離心 3-5min,，棄上清,；
3. 加新的完*培養(yǎng)基輕輕重懸細胞，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里,；
4. 補足完*培養(yǎng)基,，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。
Tips：吹打次數(shù)不宜過多,，吹打力度保持輕柔,，以免機械刺激造成細胞自分化或損傷。
RAW264.7細胞凍存方法
1. 配制程序性凍存液,，準備相應(yīng)數(shù)量凍存管并做好標記,。
Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細胞按傳代步驟獲得細胞沉淀；
3. 加入適量程序性凍存液輕輕重懸細胞,，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中,；
4. 將凍存管放入程序性凍存盒，放入-80℃冰箱過夜；
5. 轉(zhuǎn)移凍存細胞至液氮保存并登記細胞保存位置,。
Tips：
液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性,，若活性合格即可長期保存。
程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,，若使用非程序凍存液請按產(chǎn)品說明書處理降溫過程,。
T25培養(yǎng)瓶長滿通常可凍存2-3管,，10cm皿長滿通?？蓛龃?-4管。
凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細胞狀態(tài)不佳,。
RAW264.7細胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃，離心機設(shè)置好轉(zhuǎn)速,；
2. 將細胞從液氮罐取中出,，觀察管內(nèi)無液氮的情況下，捏住管蓋,，將細胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,，細胞融化至米粒大小冰塊時終止水浴，融化過程不超過2min,；
Tips：
若液氮或冰箱距離細胞房較遠,，細胞需要放在干冰或冰盒上運送至細胞房,。
凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮,，取出細胞時震動不要過大,。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,，若有液氮需靜置一會待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護,，避免凍存管炸開導(dǎo)致受傷,。
水浴時使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,，避免污染,。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,，不同離心機具體轉(zhuǎn)速會有差異
4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,，輕柔重懸細胞后接種至培養(yǎng)瓶中,，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
5. 復(fù)蘇24小時后觀察細胞貼壁情況,。
Tips：整個細胞復(fù)蘇過程在盡可能5-10min內(nèi)完成,。
RAW264.7細胞收貨方法
常溫細胞
1. 收貨后，拆開外包裝,，用75%酒精消毒T25瓶表面,，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上,；
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片,，觀察細胞密度,，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（首*傳代比例建議1：2）,，若細胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng),；
Tips：若收貨時發(fā)現(xiàn)懸浮細胞較多，應(yīng)離心收集懸浮細胞并放回原瓶
凍存細胞
1. 細胞收貨后盡快開箱檢查,，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存,，若干冰完*揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決；
2. 凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,，以免超出售后期,，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略；
3. 復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作,；
Tips：
1. 細胞收貨出現(xiàn)漏液、培養(yǎng)瓶破損,、干冰完*揮發(fā)等異常情況時,，及時拍照聯(lián)系銷售人員；
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的完*培養(yǎng)基,，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng)；
常見問題及解決方案
細胞密度怎么計算的,？
嚴格意義上,，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量，但在實際培養(yǎng)過程中,，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù),。因此，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值,，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴謹,，但也是相當(dāng)直觀、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式,。
NO.2培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理,？
1. 細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光，這個屬于細胞自身特性,，無法清除也無法改變,，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象,，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng),、營養(yǎng)缺乏,、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件,。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞,，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化，混勻細胞,，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,，棄上清。再加5mL PBS重懸細胞,，再離心后,，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿。第二次PBS重懸是為了去除碎片,，如果平時碎片比較少,，傳代時可以省略PBS重懸的步驟；如果碎片很多,，建議PBS多洗幾次,。
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