細(xì) 胞 基 本 信 息
細(xì)胞正常生長(zhǎng)形態(tài)照片
細(xì)胞名稱(chēng)：MCF 10A(人正常乳腺上皮細(xì)胞)
細(xì)胞別稱(chēng)： MCF 10A; MCF.10A; MCF10A; MCF10a; MCF-10 Attached; Michigan Cancer Foundation-10A
細(xì)胞貨號(hào): SNL-225
生長(zhǎng)特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+20ng/mL EGF+0.5μg/mL Hydrocortisone+10μg/mL Insulin+1% NEAA+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境: 空氣,，95%,；二氧化碳 (CO2),，5%,；37℃
細(xì)胞簡(jiǎn)介: MCF 10A細(xì)胞于1984年從患有纖維囊性乳房的36歲白人女性的乳腺中分離出來(lái),，來(lái)源于群體中的粘附細(xì)胞,，是一種非致瘤性上皮細(xì)胞系,。MCF 10A細(xì)胞通過(guò)電子顯微鏡觀察，顯示出管腔導(dǎo)管細(xì)胞的特征,，而不是肌上皮細(xì)胞的特征,，同時(shí)培養(yǎng)基中的鈣含量對(duì)細(xì)胞的形態(tài)有很大影響。MCF 10A細(xì)胞上皮唾液粘液,、細(xì)胞角蛋白和乳脂球抗原呈陽(yáng)性,，還表達(dá)通過(guò)與MFA乳腺和MC-5單克隆抗體的陽(yáng)性反應(yīng)檢測(cè)到的乳腺特異性抗原。MCF 10A細(xì)胞在膠原蛋白中表現(xiàn)出三維生長(zhǎng),，并在融合培養(yǎng)物中形成圓頂,。到目前為止，細(xì)胞還沒(méi)有表現(xiàn)出終末分化或衰老的跡象,。MCF 10A細(xì)胞對(duì)胰島素,、糖皮質(zhì)激素、霍亂腸毒素和表皮生長(zhǎng)因子（EGF）有反應(yīng)。MCF 10A細(xì)胞可以用于3D細(xì)胞培養(yǎng),，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主,。
MCF10A細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)
01 消化時(shí)間長(zhǎng)
MCF10A細(xì)胞消化時(shí)間較長(zhǎng)，通常需要5min或者更久,，具體時(shí)間因胰酶濃度,、效價(jià)、消化條件有所不同,，第一次對(duì)該細(xì)胞進(jìn)行消化時(shí)要摸索最佳時(shí)間（具體步驟見(jiàn)后文）,。
02對(duì)培養(yǎng)基要求高
培養(yǎng)基中胰島素、氫化可的松,、表皮生長(zhǎng)因子,、非必須氨基酸等成分對(duì)MCF10A的生長(zhǎng)有著關(guān)鍵作用，必須添加這些因子才能正常培養(yǎng),。
MCF10A細(xì)胞傳代方法
1.準(zhǔn)備所需的培養(yǎng)基,、胰酶、PBS,、離心管,、培養(yǎng)瓶以及無(wú)菌槍頭等；（試劑提前預(yù)熱）
2. 抽走培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基,，加5mL PBS潤(rùn)洗1-2遍,，清除殘留培養(yǎng)基；
3. 盡量吸干潤(rùn)洗的PBS后加1mL胰酶,，搖晃使胰酶均勻覆蓋瓶底,，放置培養(yǎng)箱37℃消化；
4. 消化時(shí)每隔1-2min拿出來(lái)觀察,，鏡下可見(jiàn)細(xì)胞明顯回縮,，輕拍培養(yǎng)瓶部分細(xì)胞開(kāi)始脫落時(shí)，吸取瓶中胰酶將細(xì)胞都吹下來(lái),，然后加入3-4mL含血清的培養(yǎng)基終止消化,，吹打混勻后立刻離心；
Tips：
注意控制吹打力度輕柔,，吹打次數(shù)不可過(guò)多,，避免機(jī)械損傷
細(xì)胞部分脫落后先用胰酶將細(xì)胞都吹下來(lái)再終止消化，避免細(xì)胞重新貼壁
5. 將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管中,，1000rpm,，3min離心收集細(xì)胞；
6. 在新的培養(yǎng)瓶中加入適量新鮮培養(yǎng)基,；（T25推薦10mL,，T75推薦15mL）
7. 離心完成后,，棄上清，加入適量新鮮培養(yǎng)基輕輕重懸吹散細(xì)胞,，將細(xì)胞懸液均勻接種至培養(yǎng)瓶中,，十字法或8字法混勻，然后放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),，注意培養(yǎng)瓶蓋透氣,；
Tips：推薦傳代比例1:2-1:4，*次傳代建議1:2,。細(xì)胞生長(zhǎng)至80%密度時(shí)即可傳代,。
MCF10A細(xì)胞凍存方法
1. 配制程序性?xún)龃嬉海瑴?zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量?jī)龃婀懿⒆龊脴?biāo)記,。
Tips：推薦凍存液配方92%FBS+8%DMSO或92%完*培養(yǎng)基+8%DMSO
2. 先將細(xì)胞按傳代步驟消化,、離心、棄上清,，獲得細(xì)胞沉淀,；
3. 加入適量程序性?xún)龃嬉狠p輕重懸細(xì)胞，并將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至凍存管中,；
4. 將凍存管放入程序性?xún)龃婧?，放?80℃冰箱過(guò)夜；
5. 轉(zhuǎn)移凍存細(xì)胞至液氮保存并登記細(xì)胞保存位置
Tips：
液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測(cè)凍存細(xì)胞的活性,，若活性合格即可長(zhǎng)期保存,。
程序性?xún)龃嬉盒枰浜铣绦蛐詢(xún)龃婧惺褂茫羰褂梅浅绦騼龃嬉赫?qǐng)按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)處理降溫過(guò)程,。
T25培養(yǎng)瓶長(zhǎng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-3管，10cm皿長(zhǎng)滿(mǎn)通?？蓛龃?-4管,。
凍存密度低將導(dǎo)致復(fù)蘇后細(xì)胞狀態(tài)不佳。
MCF10A細(xì)胞復(fù)蘇方法
1. 提前將水浴鍋預(yù)熱至37℃,，培養(yǎng)基復(fù)溫至室溫或37℃,，離心機(jī)設(shè)置好轉(zhuǎn)速,；
2. 將細(xì)胞從液氮罐取中出,，觀察管內(nèi)無(wú)液氮的情況下，捏住管蓋,，將細(xì)胞凍存部分浸入水浴鍋迅速搖晃,，細(xì)胞融化至米粒大小冰塊時(shí)終止水浴，融化過(guò)程不超過(guò)2min,；
Tips：
若液氮或冰箱距離細(xì)胞房較遠(yuǎn),，細(xì)胞需要放在干冰或冰盒上運(yùn)送至細(xì)胞房,。
凍存管在液氮長(zhǎng)期保存過(guò)程中難免滲入液氮，取出細(xì)胞時(shí)震動(dòng)不要過(guò)大,。水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,，若有液氮需靜置一會(huì)待液氮完*蒸發(fā)后再水浴。做好防護(hù),，避免凍存管炸開(kāi)導(dǎo)致受傷,。
水浴時(shí)使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源，避免污染,。
3. 直接將凍存管以離心力150g(約900rpm)左右離心2min,，不同離心機(jī)具體轉(zhuǎn)速會(huì)有差異
4. 離心完成后棄上清，用預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,，輕柔重懸細(xì)胞后接種至培養(yǎng)瓶中,，輕輕混勻后放入培養(yǎng)箱；
5. 復(fù)蘇24小時(shí)后觀察細(xì)胞貼壁情況,。
Tips：
1. 整個(gè)細(xì)胞復(fù)蘇過(guò)程在盡可能5-10min內(nèi)完成,。
2. 該細(xì)胞貼壁需要穩(wěn)定的環(huán)境，復(fù)蘇完成后請(qǐng)勿頻繁將細(xì)胞拿出觀察,。
MCF10A細(xì)胞收貨方法
?常溫細(xì)胞
1. 收貨后,，拆開(kāi)外包裝，用75%酒精消毒T25瓶表面,，放37℃培養(yǎng)箱靜置4h以上,；
2. 吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 mL，顯微鏡下拍照保存細(xì)胞狀態(tài)照片,，觀察細(xì)胞密度,，若細(xì)胞密度大于80%即可按比例傳代（*次傳代比例建議1：2），若細(xì)胞密度低于70%可以留10-12 mL繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞密度80%以上再進(jìn)行傳代培養(yǎng),；
?凍存細(xì)胞
1. 細(xì)胞收貨后盡快開(kāi)箱檢查,，若干冰充足可以取出細(xì)胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長(zhǎng)期保存，若干冰*全揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細(xì)胞并聯(lián)系銷(xiāo)售人員解決,；
2. 凍存細(xì)胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略,；
3. 復(fù)蘇一管細(xì)胞出現(xiàn)異常及時(shí)聯(lián)系銷(xiāo)售人員,，在專(zhuān)業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進(jìn)行下一步操作；
Tips：
1. 細(xì)胞收貨出現(xiàn)漏液,、培養(yǎng)瓶破損,、干冰完*揮發(fā)等異常情況時(shí)，及時(shí)拍照聯(lián)系銷(xiāo)售人員,；
2. 尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細(xì)胞內(nèi)含對(duì)應(yīng)細(xì)胞的完*培養(yǎng)基,，可以收集原裝培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,，取上清于4℃保存用于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)；
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案
細(xì)胞密度怎么計(jì)算的,？
嚴(yán)格意義上,，細(xì)胞密度需要收集細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)量，但在實(shí)際培養(yǎng)過(guò)程中,，并不需要為了精確控制細(xì)胞數(shù)量而消化細(xì)胞計(jì)數(shù),。因此，常用的細(xì)胞密度指細(xì)胞相對(duì)于最大生長(zhǎng)密度的比值,，貼壁細(xì)胞可以粗略的用細(xì)胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示,，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部，有細(xì)胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值,，當(dāng)然這種表達(dá)方式受限于單個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)不同密度時(shí)所占面積不同導(dǎo)致并不嚴(yán)謹(jǐn),，但也是相當(dāng)直觀、簡(jiǎn)便的表現(xiàn)細(xì)胞狀態(tài)的一種方式,。
NO.2培養(yǎng)過(guò)程中細(xì)胞碎片較多怎么處理,？
1. 細(xì)胞內(nèi)的黑色顆粒是細(xì)胞外分泌泡及細(xì)胞器折光，這個(gè)屬于細(xì)胞自身特性,，無(wú)法清除也無(wú)法改變,，大部分細(xì)胞都會(huì)有這種現(xiàn)象，只是不同細(xì)胞顆粒多少有區(qū)別,，細(xì)胞培養(yǎng)體系不適應(yīng),、營(yíng)養(yǎng)缺乏、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)顆粒增加,，建議使用合適的培養(yǎng)條件,。
2. 細(xì)胞外的黑色顆粒大部分是細(xì)胞碎片和細(xì)胞代謝產(chǎn)物，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤(rùn)洗清除,，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),。潤(rùn)洗不能清除的可以換液清洗后等細(xì)胞密度70-80%左右消化處理細(xì)胞，消化完成后加完*培養(yǎng)基終止消化,，混勻細(xì)胞,，收集細(xì)胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min，棄上清,。再加5mL PBS重懸細(xì)胞,，再離心后，用完*培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿,。第二次PBS重懸是為了去除碎片,，如果平時(shí)碎片比較少,，傳代時(shí)可以省略PBS重懸的步驟,；如果碎片很多,，建議PBS多洗幾次。
NO.3細(xì)胞具體消化時(shí)間是多久,？
每個(gè)實(shí)驗(yàn)室用的胰酶活力及消化步驟,、試劑都是不一樣的，不能完*規(guī)定消化時(shí)間,，以實(shí)際消化效果和實(shí)驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)為準(zhǔn),。
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