細 胞 基 本 信 息
▼細胞正常生長形態(tài)照片
細胞名稱: A-549(人肺腺癌細胞)
細胞別稱: A 549; A549; NCI-A549; A549/ATCC; A549 ATCC; A549ATCC; hA549
細胞貨號: SNL-089
生長特性: 貼壁
培養(yǎng)條件: DMEM+10% FBS+1% P/S
培養(yǎng)環(huán)境：空氣，95%,；二氧化碳 (CO2),，5%
細胞簡介：A-549細胞是于1972年由D.J.Giard等人通過從一名58歲白人男性的肺癌組織中進行外植體培養(yǎng)而建立的，角蛋白呈陽性,。M.Lieber等人的研究表明,，A549細胞可以利用胞苷二磷酸膽堿途徑合成富含不飽和脂肪酸的卵磷脂。A-549細胞可用于癌癥,、免疫腫瘤學(xué)和毒理學(xué)研究,，也是一種合適的轉(zhuǎn)染宿主。
A-549(人肺腺癌細胞)特點
01細胞顆粒感較重
細胞傳代培養(yǎng)時細胞內(nèi)黑點及細胞外顆粒較多,，建議使用優(yōu)質(zhì)血清及培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞,；
02傳代,、復(fù)蘇注意細胞狀態(tài)
細胞消化或者復(fù)蘇操作不當(dāng)容易導(dǎo)致細胞死亡裂解產(chǎn)生大量碎片及顆粒，進而影響活細胞狀態(tài),，注意消化或復(fù)蘇過程盡量輕柔,，嚴格控制消化時間和復(fù)蘇操作規(guī)范，傳代或復(fù)蘇24h后建議觀察細胞,，建議換液一次去除死亡細胞,；
細 胞 收 貨 攻 略
常溫細胞
1、T25瓶收貨后,，拆開外包裝,，用75%酒精消毒T25瓶表面，放37℃培養(yǎng)箱靜置2-4h,；
2,、吸走大部分培養(yǎng)基并留10-12 ml，顯微鏡下拍照保存細胞狀態(tài)照片,，觀察細胞密度,，若細胞密度大于80%即可按比例傳代（傳代比例建議1：2），若細胞密度低于70%可以留10-12 ml繼續(xù)培養(yǎng)至細胞密度80%以上再進行傳代培養(yǎng),；
凍存細胞
1,、細胞收貨后盡快開箱檢查，若干冰充足可以取出細胞迅速置于-80℃冰箱（2-3天內(nèi)復(fù)蘇）短期保存或液氮中長期保存,，若干冰揮發(fā)建議立即復(fù)蘇細胞并聯(lián)系銷售人員解決,；
2,、凍存細胞建議盡快復(fù)蘇一管培養(yǎng)檢查,，以免超出售后期，復(fù)蘇步驟參考復(fù)蘇攻略,；
3,、復(fù)蘇一管細胞出現(xiàn)異常及時聯(lián)系銷售人員,，在專業(yè)技術(shù)支持的指導(dǎo)下進行下一步操作；
Tips：
1.細胞收貨出現(xiàn)漏液,、培養(yǎng)瓶破損,、干冰揮發(fā)等異常情況時，及時拍照聯(lián)系銷售人員,；
2.該細胞貼壁生長,，一般T25瓶運輸過程中較少出現(xiàn)大量細胞脫落并聚團的情況，少量細胞脫落是正常狀態(tài),，不影響細胞生長,，按正常操作步驟繼續(xù)培養(yǎng)即可。
3.尚恩生物T25瓶發(fā)貨的細胞內(nèi)含對應(yīng)細胞的培養(yǎng)基,，可以收集原裝培養(yǎng)瓶內(nèi)培養(yǎng)基經(jīng)1500rpm離心5min后,，取上清于4℃保存用于后續(xù)細胞培養(yǎng),；
細 胞 傳 代 攻 略
1、先盡量吸干凈T25瓶原培養(yǎng)基,，再加3-4ml 常溫PBS輕輕潤洗細胞10-20s,，吸走潤洗的PBS；
2,、T25瓶加1ml左右胰酶,，輕輕晃動培養(yǎng)瓶以使胰酶鋪勻瓶底細胞層，將培養(yǎng)瓶放入37度培養(yǎng)箱消化,；
3,、消化到細胞間隙變大，但未脫落時加2-3ml培養(yǎng)基終止胰酶消化,；
4,、 混勻細胞，900rpm離心3-5min,，棄上清,；
5、加新的培養(yǎng)基輕輕重懸細胞,，均勻分到新的培養(yǎng)瓶里，補足培養(yǎng)基,，將培養(yǎng)瓶放回培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng),；
Tips：
1. 對于消化細胞程度，客戶如果經(jīng)驗不多,，無法準確掌控胰酶作用時間,，建議客戶按照下述操作：胰酶首先復(fù)溫到室溫后加入細胞，放入37度培養(yǎng)箱,，然后每隔30秒,，即吹打下細胞（此時吹打細胞應(yīng)盡量輕柔，不能強行將細胞吹下,，否則細胞可能出現(xiàn)機械損傷）,，如果能夠吹打散細胞，說明細胞消化完成可以終止消化,，如果30秒吹打不下,，再等30秒重復(fù)操作直至能夠輕柔的吹下細胞；
2. T25瓶加10-12ml培養(yǎng)基,，10cm皿加12-15ml,，2-3天換液一次。
3. 細胞收貨后傳代建議按1：2傳代,，后續(xù)培養(yǎng)可以視具體細胞生長狀態(tài)和密度情況決定傳代比例,；
4. 傳代后24h建議觀察細胞并換液一次去除死亡細胞,；
細 胞 凍 存 攻 略
凍存步驟
1、先將細胞按傳代步驟消化,、離心,，至傳代步驟4，棄細胞上清,，獲得細胞沉淀,；
2、加入適量預(yù)先配好的程序性凍存液輕輕重懸細胞,，并將細胞懸液轉(zhuǎn)移至做好標記的凍存管中,；
3、將凍存管放入程序性凍存盒,，放入-80℃冰箱過夜,；
4、轉(zhuǎn)移細胞至液氮保存并登記細胞保存位置,，液氮保存24h后建議復(fù)蘇一管檢測凍存細胞的活性,，若活性合格即可長期保存，若低于80%建議重新凍存,；
Tips：
1.檢測凍存細胞活性結(jié)果未合格前,，培養(yǎng)瓶內(nèi)細胞建議繼續(xù)培養(yǎng)直至確認凍存合格方可視需要丟棄；
2.程序性凍存液需要配合程序性凍存盒使用,，若使用非程序凍存液可以按產(chǎn)品說明書處理降溫過程,；
3.T25培養(yǎng)瓶長滿通常可以凍存2-3管,，10cm皿長滿可以凍存3-4管,；
細 胞 復(fù) 蘇 攻 略
復(fù)蘇步驟
1、將所需的培養(yǎng)基放在培養(yǎng)箱預(yù)熱30min后開始復(fù)蘇,；
2,、準備37度溫水，將細胞從液氮罐取中出,，觀察管內(nèi)無液氮的情況下,，捏住管蓋，將細胞凍存部分浸入溫水輕輕搖晃,，融化至米粒大小冰塊,，終止水浴,；
3,、離心完成后，棄凍存液，用剛才預(yù)熱的培養(yǎng)基緩慢加入凍存管,，并輕柔重懸細胞后接種至T25或者10cm皿中,。
Tips：
1.凍存管在液氮長期保存過程中難免滲入液氮，取出細胞時震動不要過大,，水浴前一定要觀察管內(nèi)是否存在液氮,，若有液氮建議靜置一會待液氮蒸發(fā)后再水浴,；
2.水浴時可以使用一次性PE手套包住凍存管避免直接接觸水源,，可以降低管蓋縫隙滲入水導(dǎo)致污染的概率；
3.水浴至剩米粒大小時及時終止水浴,，避免過度水浴或水浴時間不足,；
4.建議水浴完成后直接在離心管內(nèi)離心細胞，避免再次轉(zhuǎn)移細胞,；
5.復(fù)蘇后的細胞比較脆弱,，吹打和轉(zhuǎn)移細胞時盡量輕柔，復(fù)蘇24h后換液去除死亡細胞,；
常見問題及解決方案
01
細胞密度怎么計算的,？
嚴格意義上，細胞密度需要收集細胞懸液計數(shù)細胞數(shù)量,，但在實際培養(yǎng)過程中,，并不需要為了精確控制細胞數(shù)量而消化細胞計數(shù)。因此,，常用的細胞密度指細胞相對于最大生長密度的比值,，貼壁細胞可以粗略的用細胞所占培養(yǎng)容器底面積百分比表示，即顯微鏡下觀察培養(yǎng)容器底部,，有細胞的區(qū)域占總區(qū)域的百分比值，當(dāng)然這種表達方式受限于單個細胞生長不同密度時所占面積不同導(dǎo)致并不嚴謹,，但也是相當(dāng)直觀,、簡便的表現(xiàn)細胞狀態(tài)的一種方式；
02
培養(yǎng)過程中細胞碎片較多怎么處理,？
1.細胞內(nèi)的黑色顆粒是細胞外分泌泡及細胞器折光,，這個屬于細胞自身特性，無法清除也無法改變,，大部分細胞都會有這種現(xiàn)象,，只是不同細胞顆粒多少有區(qū)別，細胞培養(yǎng)體系不適應(yīng),、營養(yǎng)缺乏,、滲透壓異常等均可能導(dǎo)致細胞內(nèi)顆粒增加，建議使用合適的培養(yǎng)條件,。
2. 細胞外的黑色顆粒大部分是細胞碎片和細胞代謝產(chǎn)物,，可以先吸走培養(yǎng)基后用PBS潤洗清除,，再加新的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。潤洗不能清除的可以換液清洗后等細胞密度70-80%左右消化處理細胞,，消化完成后加培養(yǎng)基終止消化,，混勻細胞，收集細胞懸液900-1000rpm(約150g)離心3min,，棄上清,。再加5ml PBS重懸細胞，再離心后,，用培養(yǎng)基重懸接種到新的培養(yǎng)皿,。第二次PBS重懸是為了去除碎片，如果平時碎片比較少,，傳代時可以省略PBS重懸的步驟,；如果碎片很多，建議PBS多洗幾次,。
03
培細胞具體消化時間是多久,？
每個客戶用的胰酶活力及消化步驟、試劑都是不一樣的,，不能規(guī)定消化時間,，以實際消化效果和客戶經(jīng)驗為準。
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