在ELISA試劑盒操作中,，我們都認(rèn)為ELISA實(shí)驗(yàn)的原理似乎很簡單,，不外乎固定抗原，添加一抗,、二抗和底物,，間中夾雜著洗滌和封閉。然而,，即使是平淡無奇的洗滌和封閉,，如果做得不太好,，也有可能毀了整個(gè)實(shí)驗(yàn)。在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),，我們是否能獲得有意義的信息,，這在很大程度上取決于結(jié)果的信噪比。背景噪音會影響您對結(jié)果的判斷,。如何降低ELISA的背景,，下面有一些tips。

一,、洗滌很重要

洗滌步驟看似很無聊,，其實(shí)很重要，因?yàn)槿绻唇Y(jié)合的材料(如非特異結(jié)合的抗體或檢測試劑)殘留在微孔板中,，那么它會增加背景噪音,。如有必要，可增加洗滌液中的鹽濃度,，這會阻止非特異結(jié)合反應(yīng),。如果背景過高，而您懷疑洗滌不夠時(shí),，可以嘗試增加洗滌次數(shù),。

二、封閉更關(guān)鍵

封閉液的作用是讓不相關(guān)的蛋白占據(jù)微孔板中潛在的結(jié)合位點(diǎn),。這就降低了可產(chǎn)生信號的抗體非特異結(jié)合的機(jī)會,。您當(dāng)然也希望抗體只與目的蛋白結(jié)合吧。如果您的背景過高,，懷疑封閉不充分,，那么您可以嘗試使用更高濃度的封閉液，或適當(dāng)延長封閉時(shí)間,。

如果您一直被背景問題所困擾,，那么也許您該花些時(shí)間來優(yōu)化封閉液,。這可能需要時(shí)間,，但也是值得的,。目前主要有兩種類型的封閉液：蛋白和非離子型去污劑,。您使用的類型須取決于多個(gè)因素，包括微孔板的表面試劑,、吸附的抗原,、您的抗體和檢測試劑,。好的封閉液應(yīng)降低非特異性結(jié)合，但它不應(yīng)當(dāng)與抗原,、抗體或檢測試劑發(fā)生相互作用,。

一般常用的非離子型去污劑是Tween-20,。這種封閉液便宜、穩(wěn)定,，在去除洗滌過程中的一些非特異結(jié)合上很有用,。但它們只在存在時(shí)起作用，因?yàn)楹苋菀妆幌吹?。因此所有洗滌液中也必須添加封閉液,。請勿使用高濃度(正常濃度為0.01-0.1%)，它會降低特異結(jié)合,，產(chǎn)生假陰性,。另一個(gè)選擇是使用蛋白和非離子型去污劑這兩種封閉液，后者可協(xié)助洗滌過程中的封閉,。

蛋白封閉液則有所不同,，是“"的。它們與開放位點(diǎn)結(jié)合并封閉,，同時(shí)穩(wěn)定與微孔板結(jié)合的抗原分子,。常用的蛋白封閉液包括牛血清白蛋白(BSA)、脫脂奶粉,、正常血清和魚明膠,。血清組分的內(nèi)在多樣性可使它有效攔截許多不同類型的分子相互作用。不過,，它的缺點(diǎn)在于能與Protein A和IgG抗體相互作用,。解決這個(gè)問題的一種方法是使用雞或魚的正常血清。

三,、抗體濃度須優(yōu)化

我們通常會follow師兄師姐留下來的操作步驟,，但是如果試劑稍有不同，則可能需要優(yōu)化抗體的量,。記住,，非特異的抗體結(jié)合會增加背景。為了防止這一點(diǎn),，切勿使用過多的一抗或二抗,。

四、檢測試劑要適量

另一點(diǎn)也很顯而易見：切勿使用過多的檢測試劑,。如果濃度過高,，或者未正確稀釋，則會導(dǎo)致高背景,。也不要顯色過度,，如有必要，優(yōu)化一下何時(shí)應(yīng)加入終止液。

如果您的ELISA試劑盒操作中不幸地遇到了高背景,，那么也無需太擔(dān)心,，依次查看ELISA系統(tǒng)中的組分，并排除可能存在的問題,。悉心優(yōu)化,，相信很快就會有漂亮的結(jié)果。