ELISA是一種免疫測(cè)定。免疫測(cè)定（immunoassay,，IA）是應(yīng)用免疫學(xué)技術(shù)測(cè)定標(biāo)本的方法,。在臨床檢驗(yàn)中主要通過抗原抗體反應(yīng)檢測(cè)體液中的抗體或抗原性物質(zhì)。

1.1　抗原

　　抗原是能在機(jī)體中引起特異性免疫應(yīng)答的物質(zhì),?？乖M(jìn)入機(jī)體后,，可刺激機(jī)體產(chǎn)生抗體和引起細(xì)胞免疫。在免疫測(cè)定中,，抗原是指能與抗體結(jié)合的物質(zhì),。能在機(jī)體中引起抗體產(chǎn)生的抗原多為分子量大于5000的蛋白質(zhì)。小分子化合物在與大分子蛋白質(zhì)結(jié)合后能引起機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體的,，稱為半抗原（hapten）,。例如某些激素、藥物等,?？乖姆磻?yīng)性取決于抗原決定簇（antigenic determinant），或稱為表位（epitope）,。一個(gè)抗原分子可帶有不同的決定簇,。

1.2　抗體

1.2.1　抗體的結(jié)構(gòu)

　　抗體是能與抗原特異性結(jié)合的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)。Ig分五類,，即IgG,、IgA、IgM,、IgD和IgE。與免疫測(cè)定有關(guān)的Ig主要為IgG和IgM,。Ig由兩個(gè)輕鏈（L）和兩個(gè)重鏈（H）的單體組成,。Ig的輕鏈?zhǔn)窍嗤模笑剩╧appa）和λ（Lambda）兩種型別,。五類Ig的重鏈結(jié)構(gòu)不同,，這決定了它們的抗原性也不同。IgG和IgM的重鏈分別稱為γ（gamma）鏈和μ（mu）鏈,。

　　重鏈和輕鏈的N端的氨基酸排列順序因各種抗體而異,，稱為可變區(qū)，分別用VH和VL表示,。兩者構(gòu)成抗體的抗原結(jié)合部位,，只與相應(yīng)的抗原決定簇匹配，發(fā)生特異性結(jié)合,，是抗體專一性結(jié)合抗原的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),。

　　IgG可被木瓜蛋白酶分解為三個(gè)區(qū)段，其中兩個(gè)相同的區(qū)段稱抗原結(jié)合片段（Fab）,。每個(gè)Fab都保存結(jié)合抗原的能力,，但只有一個(gè)抗原結(jié)合位點(diǎn)，是單價(jià)的,，與抗原結(jié)合后不出現(xiàn)凝集或沉淀,。另一區(qū)段稱Fc段,，無抗體活性，但具有IgG*

的抗原性,。

　　IgG可被Pepsin分解為兩個(gè)片段,，一個(gè)Fab雙體，稱F（ab'）2,，能和兩個(gè)相同的抗原結(jié)合,；另一片段類似Fc，隨后被分解成小分子多肽,，無生物活性,。

　　IgM是由五個(gè)單體組成的五聚體，含10個(gè)重鏈和10個(gè)輕鏈,，具有10個(gè)抗原結(jié)合價(jià),，由于空間位置的影響，只表現(xiàn)為五個(gè)抗原結(jié)合價(jià),。IgM分子量約為900000,，IgG分子量約為150000。

機(jī)體被微生物感染后,，先產(chǎn)生IgM抗體,，然后產(chǎn)生IgG抗體。經(jīng)過一段時(shí)間,，IgM抗體量逐漸減少而消失,，而IgG抗體可長(zhǎng)期存在，在疾病結(jié)束后可持續(xù)數(shù)年之久,。

IgM抗體一般為保護(hù)性抗體,，具有免疫性。因此IgM抗體的測(cè)定,，對(duì)某些傳染病如甲型肝炎有較高的臨床診斷價(jià)值,。

1.2.2 　抗體的產(chǎn)生

　　機(jī)體受抗原刺激后，B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的抗體,。含有抗體的血清稱為抗血清（antiserum）,。每一系B細(xì)胞只產(chǎn)生針對(duì)某一抗原決定簇的抗體。如將多種抗原或含有多個(gè)抗原決定簇的抗原注入機(jī)體,，則將由多系的B細(xì)胞產(chǎn)生相應(yīng)的多種抗體,，這些抗體均存在于免疫血清中。免疫測(cè)定中所用的抗血清一般用抗原免疫兔,、羊或馬制得,。產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞可在體外與繁殖力強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞融合成雜交瘤細(xì)胞。將單個(gè)雜交瘤細(xì)胞分離,，在體內(nèi)或體外培養(yǎng)而分泌的抗體單克隆抗體（monoclonal antibody,，McAb或Mab）,。單克隆抗體僅針對(duì)一種抗原決定簇，具有很高的特異性,。單克隆抗體通常用抗原免疫小鼠制備,。將免疫的脾細(xì)胞（含產(chǎn)生抗體的B細(xì)胞）與小鼠腫瘤細(xì)胞融合，分離雜交瘤細(xì)胞,，接種于小鼠腹腔,，產(chǎn)生的腹水中含有濃度很高的單克隆抗體。

1.3　抗原抗體反應(yīng)

1.3.1　可逆性   抗原與抗體結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物的過程是一種動(dòng)態(tài)平衡,，其反應(yīng)式為：Ag+Ab→Ag·Ab,。.抗體的親和力（affinity）是抗原抗體間的固有結(jié)合力，可以平衡常數(shù)K表示：K=[Ag·Ab]／[Ag][Ab],。Ag·Ab的解離程度與K值有關(guān),。高親和力抗體的抗原結(jié)合點(diǎn)與抗原的決定簇在空間構(gòu)型上非常適合，兩者結(jié)合牢固,，不易解離,。解離后的抗原或抗體均能保持原有的結(jié)構(gòu)和活性，因此可用親和層析法來提純抗原或抗體,。在抗血清中,，特異性的IgG抗體僅占總IgG中的極小部分。用親和層析法提取的特異性抗體,，稱為親和層析純抗體,，應(yīng)用于免疫測(cè)定中可得到更好的效果。

1.3.2　最適比例   在恒定量的抗體中加入遞增量的抗原形成抗體復(fù)合物（沉淀）的量見圖1-4,。曲線的高峰部分是抗原抗體比例最合適的范圍，稱為等價(jià)帶（zone of equivalence）,。在等價(jià)帶前后分別為抗體過剩帶和抗原過剩帶,。如果抗原或抗體極度過剩，則無沉淀物形成,，在免疫測(cè)定中稱為帶現(xiàn)象（zone phenomenon）,。抗體過量稱為前帶（prezone）,，抗原地過量稱為后帶（postzone）,。在用免疫學(xué)方法測(cè)定抗原時(shí)，應(yīng)使反應(yīng)系統(tǒng)中有足夠的抗體量,，否則測(cè)得的量會(huì)小于實(shí)際含量,，甚至出現(xiàn)假陰性。

1.3.3　特異性   抗原抗體的結(jié)合實(shí)質(zhì)上只發(fā)生在抗原的抗原決定簇與抗體的抗原結(jié)合位點(diǎn)之間,。由于兩者在化學(xué)結(jié)構(gòu)和空間構(gòu)型上呈互補(bǔ)關(guān)系,，所以抗原抗體反應(yīng)具有高度的特異性,。例如乙肝病毒中的表面抗原（HBsAg）、e抗原（HBeAg）和核心抗體（HBcAg）,，雖來源于同一病毒,，但僅與其相應(yīng)的抗體結(jié)合，而不與另外兩種抗體反應(yīng),?？乖贵w反應(yīng)的這種特異性使免疫測(cè)定能在一非常復(fù)雜的蛋白質(zhì)化合物（例如血清）中測(cè)定某一特定的物質(zhì)，而不需先分離待檢物,。

　　但是這種特異性也不是絕對(duì)的,。假使兩種化合物有著部分相同的結(jié)構(gòu)，在抗原抗體反應(yīng)中可出現(xiàn)交叉反應(yīng),。例如：絨毛膜hCG和黃體生成激素（LH）均由α和β兩個(gè)亞單位組成,，其結(jié)構(gòu)的不同處在β亞單位，而兩者的α亞單位是同類的,。用hCG免疫動(dòng)物所得的抗血清中含有抗α-hCG和抗β-hCG兩種抗體,，抗α-hCG抗體將與LH發(fā)生交叉反應(yīng)。在臨床檢驗(yàn)中,，如用抗hCG抗血清作為妊娠診斷試劑檢定尿液中hCG,，只能用于hCG濃度較高的試驗(yàn)，否則婦女生理性排泄入尿液中的微量LH將與之發(fā)生交叉反應(yīng),。因此在作為早孕診斷（敏感度應(yīng)達(dá)到50mIu/mlhCG）的實(shí)際中必須應(yīng)用只對(duì)hCG特異的抗β-hCG,，以避免與其它激素的交叉反應(yīng)的發(fā)生。

1.3.4　敏感性   在測(cè)定血清中某一物質(zhì)的含量時(shí),，化學(xué)比色法的敏感度為mg/ml水平,，酶反應(yīng)測(cè)定法的敏感度約為5~10μg/ml，免疫測(cè)定中凝膠擴(kuò)散法和濁度法的敏感度與酶反應(yīng)法相仿,。標(biāo)記的免疫測(cè)定的敏感度可提高數(shù)千倍,，達(dá)ng/ml水平。例如,，用放射免疫測(cè)定法或酶免疫測(cè)定法測(cè)定HBsAg,，其敏感度可達(dá)0.1ng/ml。

1.4　免疫測(cè)定在臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用

　　由于各種抗原成份,，包括小分子的半抗原,，均可用以制備特異性的抗血清或單克隆抗體，利用此抗體作為試劑就可檢測(cè)標(biāo)本中相應(yīng)的抗原,，因此免疫測(cè)定的應(yīng)用范圍極廣,，在臨床檢驗(yàn)中可用于測(cè)定：

    1) 體液中的各種蛋白質(zhì)，包括含量極少的蛋白質(zhì)如甲胎蛋白等,。

    2) 激素,，包括小分子量的甾體激素等,。

    3) 抗生素和藥物。

    4) 病原體抗原,，HBsAg,、HBeAg等。

    5) 另外,，也可利用純化的抗原檢測(cè)標(biāo)本中的抗體,，例如抗-HBs等。

1.5． 標(biāo)記的免疫測(cè)定

　　如上所述,，免疫測(cè)定是一種很敏感的測(cè)定方法,，抗原抗體反應(yīng)后直接測(cè)定形成的沉淀或濁度，敏感度可達(dá)5~10μg/ml,，但在臨床檢驗(yàn)中,，某些待測(cè)物在標(biāo)本中的含量遠(yuǎn)低于這一水平，因此要尋找增加敏感度的方法,。標(biāo)記的免疫測(cè)定是將檢測(cè)試劑中的抗原或抗體用可微量測(cè)定的物質(zhì)加以標(biāo)記,，通過測(cè)定標(biāo)記物來提高敏感度。在放射免疫測(cè)定和酶免疫測(cè)定中,，標(biāo)記物分別為放射性核素和酶,，最后用測(cè)定放射性和酶活力來計(jì)算待檢物的量，敏感度可比直接測(cè)定沉淀物提高數(shù)百至數(shù)千倍,。在標(biāo)記免疫測(cè)定中,，一般加入過量的標(biāo)記試劑以保證與待測(cè)物*反應(yīng)。以標(biāo)記抗體（Ab※）檢測(cè)抗原（Ag）為例,，反應(yīng)式如下：Ag+ Ab※ → AgAb※+ Ab※,。在反應(yīng)產(chǎn)物中有與Ag結(jié)合的Ab※和游離和Ab※，如不將兩者分離而測(cè)定標(biāo)記物,，測(cè)得的結(jié)果將為兩者之和,。因此，游離標(biāo)記物與結(jié)合標(biāo)記物的分離是標(biāo)記免疫測(cè)定中的重要步驟,?？刹捎枚喾N手段,，固相載體是其中之一,。如將抗原或抗體包被在固相載體上，然后再與標(biāo)記的抗原或抗體直接反應(yīng),，結(jié)合的標(biāo)記物被固定在載體上,，而游離的標(biāo)記物留于溶液中。這樣可以通過洗滌將游離的Ab※除去,，結(jié)合標(biāo)記物的測(cè)定可在固相上進(jìn)行,。

1.6．酶免疫測(cè)定

　　酶免疫測(cè)定（enzyme immunoassay）可分為均相（homogenous）和非均相（heterogenous）兩種類型,。在均相EIA中可不需進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離而直接測(cè)定標(biāo)記物。例如在某種條件下,，抗原抗體反應(yīng)后形成的酶標(biāo)記抗原抗體復(fù)合物中的酶失去其對(duì)底物作用的活力,，因而測(cè)出的酶活力直接反映游離的酶標(biāo)記物。均相EIA在臨床檢驗(yàn)中較少應(yīng)用,。非均相EIA需先進(jìn)行游離的和結(jié)合的標(biāo)記物的分離,。如前所述，固相載體可用作一種分離手段,。這種固相酶免疫測(cè)定方法在1971年最初建立時(shí)稱為酶聯(lián)免疫吸附劑測(cè)定（enzyme linked immunosorbent assay）,，簡(jiǎn)稱ELISA，在國內(nèi)有譯作酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)或酶標(biāo),，已習(xí)用,。