C43(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86082-01(10×100ul)/BFNC86082-02(50×100ul)

C43(DE3) pLysS：                                       100μl/支

pUC19 (control vector，10pg/μl):                    10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                             -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^–ompT hsdS_B (r_B^- m_B^-) gal dcm (DE3)pLysS Cam^R

產(chǎn)品說(shuō)明

OverExpress C43(DE3),、OverExpress C41(DE3)兩個(gè)菌株均起源于BL21(DE3),，其優(yōu)點(diǎn)是可以高效表達(dá)毒性蛋白或疏水性蛋白。OverExpress C41(DE3)跟BL21(DE3)的區(qū)別在于其基因組含有至少一個(gè)未知突變,，這個(gè)未知突變使其獲得了高效表達(dá)毒性蛋白的能力,，此突變位點(diǎn)參與大腸桿菌表達(dá)毒性蛋白時(shí)的細(xì)胞死亡途徑,；OverExpress C43(DE3)來(lái)源于OverExpress C41(DE3)，是通過(guò)篩選OverExpress C41(DE3)對(duì)另一個(gè)不同毒性蛋白的抗性菌株獲得,。C43(DE3)菌株具有比C41(DE3)更強(qiáng)的表達(dá)毒性蛋白和疏水性蛋白的能力,。將具有氯霉素抗性的pLysS質(zhì)粒導(dǎo)入C43(DE3)細(xì)胞中即是C43(DE3) pLysS，pLysS表達(dá)T7溶菌酶,，T7溶菌酶可以與T7 RNA聚合酶結(jié)合抑制其轉(zhuǎn)錄活性,，進(jìn)而降低目的基因的背景表達(dá)水平，但不干擾IPTG誘導(dǎo)的表達(dá),，非常適合毒性蛋白的原核表達(dá),。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶),，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶,，可用于pET系列，pGEX,，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá),。

青旗生物生產(chǎn)的C43(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá)1×10⁸ cfu/μg DNA,。

操作方法

1. C43(DE3)pLysS感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出,，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化,，加入目的質(zhì)粒,，并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打)，冰中靜置25分鐘,。

2. 42℃水浴熱激45秒,，迅速放回冰中并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率,。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的 LB無(wú)菌培養(yǎng)液,，37℃，200 rpm復(fù)蘇60分鐘,。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌,，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含34 µg/ml氯霉素及所選質(zhì)粒篩選抗生素的LB培養(yǎng)基上。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng),。

C43(DE3) pLysS感受態(tài)細(xì)胞

IPTG配制：

Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside) by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素配制

         Chloramphenicol  34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 µg/ml.

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞盡量在冰中緩慢融化,，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng),，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率,。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少終用于涂板的菌量,。

3. 誘導(dǎo)時(shí),，IPTG濃度可選（0.1-2 mM均可）,。

4. 為獲得需要量的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間,，溫度,，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化。

5. C43(DE3)pLysS 菌株攜帶 pLysS質(zhì)粒,，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無(wú)抗生素外,，其余所用培養(yǎng)基、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34 µg/ml氯霉素,，以防質(zhì)粒丟失,。