Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

產(chǎn)品規(guī)格CAT#: BFNC86077-01(10×100ul)/BFNC86077-02(50×100ul)

Rosetta 2(DE3)：                                               100μl/支

pUC19 (control vector,，10pg/μl):                           10μl

保存條件(保質(zhì)期)：                                   -80℃（6個(gè)月）

基因型

F^- ompT hsdS_B(r_B^- m_B^-) gal dcm (DE3) pRARE2 (Cam^R)

產(chǎn)品說(shuō)明

Rosetta 2(DE3)菌株來(lái)源于BL21,，是BL21的衍生菌株,，為L(zhǎng)on蛋白酶和膜外蛋白酶OMPT的缺陷型菌株,，這兩種酶的缺失有效防止異源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)的降解。將具有氯霉素抗性的pRARE2質(zhì)粒導(dǎo)入BL21 (DE3)細(xì)胞中即是Rosetta 2(DE3),，pRARE2質(zhì)?？裳a(bǔ)充大腸桿菌缺乏的7種稀有密碼子(AUA, AGG, AGA, CUA, CCC, GGA和CGG)對(duì)應(yīng)的tRNA，提高外源基因的表達(dá)水平,。該菌株染色體整合了λ噬菌體DE3區(qū) (DE3區(qū)含有T7噬菌體RNA聚合酶),，可同時(shí)表達(dá)T7 RNA聚合酶和大腸桿菌RNA聚合酶，可用于pET系列,，pGEX,，pMAL等質(zhì)粒的蛋白表達(dá)。

青旗生物生產(chǎn)的Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)10⁸ cfu/μg DNA,。

操作方法

1. Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞從-80℃拿出,，迅速插入冰中，5分鐘后待菌塊融化,，加入目的質(zhì)粒并用手bo打EP管底輕輕混勻(避免用槍吸打),，冰中靜置25分鐘。

2. 42℃水浴熱激45秒,，迅速放回冰中并靜置2分鐘,，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。

3. 向離心管中加入700 μl不含抗生素的LB無(wú)菌培養(yǎng)液,，37℃,，200 rpm復(fù)蘇60分鐘。

4. 5000 rpm離心一分鐘收菌,，留取50 μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基上,。

5. 將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。

Rosetta 2(DE3)感受態(tài)細(xì)胞

IPTG配制：

    Prepare a 1 M solution of IPTG (Isopropyl-β-D-thiogalactoside; Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside)

    by dissolving 2.38 g of IPTG in dd water and adjust the final volume to 10 ml. Filter sterilize before use.

氯霉素配制

Chloramphenicol  34 mg/ml in ethanol. Store at -20℃. Use at 34 µg/ml.

注意事項(xiàng)

1. 感受態(tài)細(xì)胞盡量在冰中緩慢融化,，插入冰中8分鐘內(nèi)加入目標(biāo)DNA,，不可在冰中放置時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，長(zhǎng)時(shí)間存放會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率,。

2. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)?？上鄳?yīng)減少終用于涂板的菌量。

3. 誘導(dǎo)時(shí),，IPTG濃度可選（0.1-10 mM均可）,。

4. 為獲得需要量的蛋白，誘導(dǎo)時(shí)間,，溫度,，IPTG濃度需實(shí)驗(yàn)者優(yōu)化,。

5. Rosetta 2(DE3) 菌株攜帶 pRARE2質(zhì)粒,，除復(fù)蘇培養(yǎng)基為無(wú)抗生素外，其余所用培養(yǎng)基,、培養(yǎng)液均應(yīng)含有34 µg/ml氯霉素,，以防質(zhì)粒丟失。