摘要

標(biāo)準(zhǔn)化細(xì)胞移植物,、人工器官替代物和生化產(chǎn)品的組織和生物制造需要可控且可重復(fù)的離體組織生長培養(yǎng)物,，以準(zhǔn)確模擬體內(nèi)環(huán)境。生物反應(yīng)器可以創(chuàng)建這些生理相關(guān)環(huán)境，并且可以針對(duì)特定微生物（例如細(xì)胞類型或細(xì)菌）進(jìn)行定制,，以優(yōu)化3D微生物和組織培養(yǎng),。但直到現(xiàn)在，尋找一種時(shí)間和成本效益高的生物反應(yīng)器生產(chǎn)方案仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)。本技術(shù)說明提出了使用由 Volumetric和BIO X6™ 提供支持的Lumen X+™設(shè)計(jì)和制造生物反應(yīng)器的工作流程解決方案,。首先,，本技術(shù)說明詳細(xì)介紹了如何在數(shù)字光處理 (DLP) Lumen X+ 生物打印機(jī)上制造封閉式生物反應(yīng)器,。該技術(shù)說明還演示了BIO X6如何在生物反應(yīng)器內(nèi)創(chuàng)建精確的共細(xì)胞和多細(xì)胞培養(yǎng)物以完成工作流程,。

介紹

培養(yǎng)細(xì)胞和細(xì)菌讓研究人員能夠研究活材料和合成生物系統(tǒng)的體外和體內(nèi)行為,，這是一種適用于微生物生物學(xué),、機(jī)械生物學(xué),、疾病建模、藥物發(fā)現(xiàn)和生物制造等眾多領(lǐng)域的有用實(shí)驗(yàn)方法（Kapa?czyńska, 2016; Shen, 2020; Vukasovic, 2019）。自從 Ross G. Harrison 于 1907 年開發(fā)出這項(xiàng)技術(shù) (Harrison, 1907) 以來,，2D 培養(yǎng)就一直在進(jìn)行,，它仍然是zui流行的方法之一,，盡管它不能準(zhǔn)確地模擬自然環(huán)境，因?yàn)榧?xì)胞或微生物在燒瓶或培養(yǎng)皿上以單層的形式生長-可能已經(jīng)或可能沒有功能化的培養(yǎng)皿表面（Estermann,，2021,；Hirt，2015,；Kapa?czyńska,；Shen），極大地改變了微生物特性,，從分化到活力再到刺激反應(yīng)行為再到藥物代謝（Kapa?czyńska）,。因此，二維實(shí)驗(yàn)結(jié)果很難轉(zhuǎn)化為體內(nèi)應(yīng)用,，尤其是藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)方面的疾病研究（Hirt,；Shen）,。為了獲得最佳實(shí)驗(yàn)性能，當(dāng)今許多研究人員更喜歡 3D 培養(yǎng)方法,。

最近的技術(shù)進(jìn)步和生物打印機(jī)的商業(yè)可用性使得設(shè)計(jì),、快速原型制作和可靠地生產(chǎn) 3D 培養(yǎng)變得更加容易,。一種流行的方法是在生物反應(yīng)器中進(jìn)行 3D 培養(yǎng),，或制造組織工程設(shè)備來模擬活細(xì)胞的生理環(huán)境,。生物反應(yīng)器因其廣泛的應(yīng)用而受到關(guān)注,，例如移植物（Lee，2021；Notorgiacomo，2021；Tsimbouri,，2017,；Vukasovic）,，改善球體和類器官成熟（Cho,，2021,；Qian,，2016,；Shen,；Velasco,，2020）,，培養(yǎng)干細(xì)胞（Rodrigues，2011 年）和制造工程活菌療法（Charbonneau,，2020年）,。生物反應(yīng)器還有可能在降低成本的同時(shí)提高實(shí)驗(yàn)的可重復(fù)性（Franzen，2019年）,，使研究人員能夠更有效地將他們的發(fā)現(xiàn)（Morgan,，2018年）轉(zhuǎn)化為臨床批準(zhǔn)的療法（Sarkar,，2015 年）和活體材料植入物。鑒于這些潛力,，以下工作流程演示了使用 Lumen X+ 和 BIO X6 來制造具有生物打印,、載有細(xì)胞的生物材料的生物反應(yīng)器。

材料和模型

模型設(shè)計(jì)

使用的生物反應(yīng)器是在OnshapeCAD（計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)）軟件的幫助下設(shè)計(jì)的,，并以兩個(gè) STL（標(biāo)準(zhǔn)鑲嵌語言）文件導(dǎo)出,。生物反應(yīng)器的兩部分包括底部和用于擠出生物打印的隔間（打印室，圖2）和用于密封設(shè)備并創(chuàng)建封閉生物反應(yīng)器的蓋子,。 打印室和蓋子均由直徑為 10 毫米的網(wǎng)狀底部組成,，允許封裝基質(zhì)和周圍介質(zhì)之間進(jìn)行交換,。

制造

使用 Lumen X+ DLP 生物打印機(jī)和光聚合聚乙二醇二丙烯酸酯 PEGDA500 PhotoInk™ 對(duì)生物反應(yīng)器進(jìn)行生物打印,。 之所以選擇  Lumen  X+，是因?yàn)樯锓磻?yīng)器的微米特征尺寸需要精確的光刻（光固化）制造,。 PEGDA 已廣泛用于生物學(xué),，通過細(xì)胞粘附域功能化或與 GelMA 等生物材料結(jié)合，以封裝細(xì)胞或創(chuàng)建功能化支架以指導(dǎo)細(xì)胞定向和增殖,。 PEGDA500 PhotoInk 是一種*的生物相容性和不可降解的 PhotoInk,，專為 Lumen X+ 設(shè)計(jì)。 其強(qiáng)大的機(jī)械性能允許創(chuàng)建具有低至 200 µm 分辨率細(xì)節(jié)的薄壁,、微流體裝置和*的晶格結(jié)構(gòu),，使其成為創(chuàng)建藥物輸送裝置的理想選擇。

將生物反應(yīng)器的 STL 模型導(dǎo)入 Lumen X+ 并使用 Lumen X+ LightField 軟件以 50 µm 的更高分辨率設(shè)置進(jìn)行切片,。 Lumen X+ 為每個(gè)型號(hào)加載了 1 mL 的 PEGDA500 PhotoInk,，并根據(jù) PEGDA500 PhotoInk 的協(xié)議設(shè)置了功率設(shè)置。 打印后,，構(gòu)建體被水合,，然后使用塑料剃須刀片小心地從構(gòu)建平臺(tái)上移除。 然后在去離子水中洗滌生物反應(yīng)器以去除光吸收染料和未固化的樹脂,。 最后,，在使用擠出生物打印將細(xì)胞打印到打印室之前，將構(gòu)建體以水合狀態(tài)儲(chǔ)存幾天,。

圖 3. 生物反應(yīng)器室的打印后清洗

光吸收染料具有無毒成分,，并且在本技術(shù)說明中進(jìn)行的儲(chǔ)存步驟是可選的。為了獲得最佳的顯微鏡條件,，建議去除多余的光吸收染料,。如果不需要顯微鏡，則可以在清洗后立即進(jìn)行基于擠出的生物打印步驟,，以去除未固化的 PhotoInk,。對(duì)于載有細(xì)胞的構(gòu)建體,，建議使用平衡緩沖液或細(xì)胞培養(yǎng)基作為洗滌溶液。

對(duì)于進(jìn)入打印室的生物打印,，使用了配備標(biāo)準(zhǔn)氣動(dòng)打印頭和 CELLINK Bioink 的 BIO X6,。選擇一個(gè)直徑為 10 毫米、高 1 毫米的圓柱形模型,，并使用 DNA Studio 軟件進(jìn)行調(diào)整,，最終直徑為 8  毫米，共三層,。固化擠出的生物墨水后,，生物反應(yīng)器蓋的邊緣用  PEGDA500  覆蓋，然后將其放置在打印室的頂部以將其關(guān)閉,。最后,，使用 BIO X6 的 405 nm 光固化模塊密封該設(shè)備，定位在 3 cm 處以照亮支架 15 秒,。密封生物反應(yīng)器是可選的,，打印室可以像Transwell 系統(tǒng)一樣單獨(dú)使用，也可以用于氣液界面 (ALI) 培養(yǎng),。

圖 4. 生物打印物體實(shí)物,。

總結(jié)

在組織工程和細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，將器官芯片和生物反應(yīng)器技術(shù)相結(jié)合是更好地概括人類生理學(xué)以提高培養(yǎng)準(zhǔn)確性和效率的關(guān)鍵因素,。在本技術(shù)說明中,，基于 DLP 的高分辨率 Lumen X+ 生物打印機(jī)與基于多材料擠壓的生物打印相結(jié)合，在可用作生物反應(yīng)器,、Transwell 系統(tǒng)或共培養(yǎng)室的腔室中創(chuàng)建了一個(gè)活支架,。

 生物反應(yīng)器可以放置在經(jīng)典的 24 孔板中，*或部分浸入細(xì)胞培養(yǎng)基中,。多孔系統(tǒng)允許打印室內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)水合和循環(huán),。此外，該生物反應(yīng)器可以在沒有蓋子的情況下用作經(jīng)典的 ALI 系統(tǒng),，用于皮膚組織模型的生長,。

除了組織工程應(yīng)用之外，還可以在生物反應(yīng)器的腔室中放置其他元件,。例如,，可以將封裝在珠子中的細(xì)胞放入培養(yǎng)箱中，通過將系統(tǒng)置于攪拌下,，例如 C.BIRD™ 系統(tǒng) (CYTENA) 進(jìn)行懸浮培養(yǎng),。另一種方法是使用腔室中的一種介質(zhì)和井中的一種介質(zhì)來創(chuàng)建雙室配置、梯度系統(tǒng)或基于兩種溶液之間交換的動(dòng)態(tài)流動(dòng)。

通過在生物打印水凝膠的兩側(cè)安排細(xì)胞,，然后通過腔室的孔監(jiān)測交換,、通訊和定殖以進(jìn)行細(xì)胞遷移/侵襲研究，共培養(yǎng)方法也很有趣,。該腔室還可以用 ECM（細(xì)胞外基質(zhì)）元件進(jìn)行功能化以促進(jìn)細(xì)胞粘附,，并且可以添加趨化分子以促進(jìn)遷移。此外,，PEGDA500 腔室可以裝載藥理學(xué)分子以形成藥物釋放支架,。