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生物打印協(xié)議GelXA LAMININK
這是一個(gè)建議的程序,，請(qǐng)根據(jù)你的實(shí)驗(yàn)需要進(jìn)行調(diào)整,。保持產(chǎn)品的無(wú)菌性，在無(wú)菌條件下工作,。
協(xié)議目標(biāo)
該協(xié)議的目的是提供使用 INKREDIBLE,、INKREDIBLE+、BIO X 或 BIO X6 的 GelXA LAMININK 生物墨水進(jìn)行生物打印的說(shuō)明,，有無(wú)細(xì)胞,。 GelXA LAMININK 系列包括GelXA LAMININK 111 、GelXA LAMININK 121 ,、GelXA LAMININK 411 ,、GelXA
LAMININK 521 和 GelXA LAMININK+。 本文件涵蓋了與細(xì)胞的預(yù)打印混合,、3D 生物打印和離子交聯(lián)或通過(guò)光固化的后打印過(guò)程,。 該方案針對(duì) GelXA LAMININK 進(jìn)行了優(yōu)化，其中 LAP 0.25% 未稀釋以及 10+1 細(xì)胞懸液稀釋,。 改變LAP 或 bioink 的濃度與細(xì)胞懸浮液的比例會(huì)改變光交聯(lián)時(shí)間,。 參考光交聯(lián)優(yōu)化協(xié)議來(lái)調(diào)整和確定這些數(shù)字,。 該協(xié)議通過(guò)使用 BIO X 和 BIO X6 的溫控打印頭進(jìn)行了優(yōu)化。 1
所需材料
- GelXA LAMININK Bioink*
- 交聯(lián)劑*（隨bioink采購(gòu)一起提供）
- 紫外線屏蔽盒,，3cC*
- 無(wú)菌錐形生物打印噴嘴,，22-27g推薦*
- BioX*、BioX6*或Inkredable系列*3D Bioprinter
- 井板或培養(yǎng)皿*
- 用于光固化的405或365納米光模塊
- 細(xì)胞+細(xì)胞培養(yǎng)基
- 3毫升帶Luer鎖連接的注射器
- 陰/陰路厄鎖適配器*或
- 細(xì)胞混合器*
如果從橙色防紫外線墨盒轉(zhuǎn)印,，請(qǐng)保持生物墨水不受光影響,，以避免在打印前交聯(lián)。在黑暗模式下使用3D打印機(jī),。光引發(fā)劑對(duì)反復(fù)或長(zhǎng)時(shí)間暴露于熱敏感,。
協(xié)議
使用BIO X或BIO X6，在15°C下冷卻打印床,，在24°C下溫控打印頭時(shí),，該協(xié)議工作*佳。GelXA層狀油墨也可以使用氣動(dòng)打印頭或可噴墨系列進(jìn)行擠壓,，但如果環(huán)境溫度超過(guò)25°C且打印頭發(fā)熱,，則形狀保真度會(huì)降低。如果使用可噴墨系列,，打印基材如培養(yǎng)皿或孔板應(yīng)放置在冰上或另一個(gè)冷卻的表面上,，以便在打印后熱凝膠結(jié)構(gòu)，然后再進(jìn)行光交聯(lián),。
| 步驟 | 標(biāo)題 | 材料 | 說(shuō)明 |
| 1 | 準(zhǔn)備生物墨水 | - GelXA LAMININK | 如果不使用單元格打印,，則直接轉(zhuǎn)到第 3 步。 - 在墨盒/注射器中加熱 GelXA LAMININK |
| 在 37°C 下保持 10 分鐘,。 GelXA LAMININK 的加熱可以在氣動(dòng)打印頭,、水浴或培養(yǎng)箱中進(jìn)行。 長(zhǎng)時(shí)間和重 復(fù)加熱會(huì)對(duì)光引發(fā)劑的穩(wěn)定性和生物墨水的均勻性產(chǎn) | |||
| 生負(fù)面影響,，需要在添加細(xì)胞之前進(jìn)行額外的混合,。如果不在墨盒中使用整個(gè) 3 mL 的 bioink，請(qǐng)使用女性 /女性 Luer 鎖適配器將所需的量轉(zhuǎn)移到注射器中,，并在最佳存儲(chǔ)條件下保留其余的 bioink,。 | |||
| 注意：如果 bioink 中有氣泡，請(qǐng)?jiān)?/span> 1600 rpm 下快速離心 1.5 分鐘,。 | |||
| 2 | 將 GelXA LAMININ K 與細(xì)胞混合 |
- 細(xì)胞懸液 - 細(xì)胞混合器 - 母/母魯爾鎖適配器 - 帶 Luer 鎖連 接 的 3 mL 注射器 - 預(yù)熱的GelXA LAMININK |
此時(shí),，將十份bioink 與一份細(xì)胞懸液混合，注意不要將氣泡引入混合物中,。有關(guān)詳細(xì)說(shuō)明，請(qǐng)參閱Mixing Cells Protocol GelX 系列,。 - 使用母/母Luer 鎖適配器將細(xì)胞懸浮液轉(zhuǎn)移到 1 mL 細(xì)胞注射器（第1 部分）,。 - 使用母/母Luer 鎖接頭將GelXA LAMININK 轉(zhuǎn)移到 12 mL 注射器（第2 部分）,。 - 將兩個(gè)注射器夾在分配裝置上（第3 部分）。 - 將兩個(gè)注射器連接到混合裝置（第4 部分）,，然后將空藥筒（第5 部分）從另一側(cè)連接到混合裝置,。 - 在分配裝置上輕輕施加壓力，將兩個(gè)注射器的內(nèi)容物混合到空藥筒中,。 注意：為避免在混合bioink 和細(xì)胞懸浮液時(shí)出現(xiàn)氣隙,，請(qǐng)?jiān)?/span>將注射器與細(xì)胞懸浮液連接之前小心地用 GelXA LAMININK 預(yù)填充Luer 鎖適配器。 如果準(zhǔn)備 <2 mL 的 GelXA LAMININK,，建議連接兩個(gè) 3 mL 魯爾鎖注射器,，并在注射器之間來(lái)回混合bioink，直到它變得均勻,。 |
| 3 | 冷卻并裝入墨盒 |
- 紫外線屏蔽zi彈,3CC 裝入格爾克薩 層壓 （ 及 細(xì)胞） - 無(wú)菌錐形生物打印 噴嘴, 22- 27g |
- 將墨盒放置在%1的計(jì)數(shù)器上0-20分鐘到觸角 房間 溫度,。 如果 這個(gè) 生物墨水 有 被預(yù)熱后, 它 罐頭 取而代之的是 是 放置 在 a 冰箱對(duì)于 3-5分鐘，或在溫度控制下 打印頭 在24°C 對(duì)于 5 分鐘數(shù) 對(duì)于 更快 冷卻,。 注： 房間 溫度 是 在內(nèi)部 20-25°C,。 - 將室溫回火的GelXA層狀油墨放入 打印頭和帶有打印噴嘴的帽。如果 使用 這個(gè) 生物X 或生物 X6,， 預(yù)冷這個(gè)打印床至 15°C,。 |
| 注意：使用GelXA LAMININK打印時(shí)， 推薦 打印頭 溫度 對(duì)于 這個(gè)高 打印 保真度 是 20- 25°C,， 雖然 這個(gè)生物墨水 罐頭 是 分配 向上 至 32°C,。 | |||
| 4 | 打印 |
- 生物穿孔結(jié)構(gòu)與參數(shù) 根據(jù) 至表1。如果打印適性不理想,，請(qǐng)調(diào)整壓力上升/下降1 kPa以擠出更多/更少 材料,。 - 如果打印頭在長(zhǎng)時(shí)間打印過(guò)程中發(fā)熱 會(huì)議或環(huán)境溫度超過(guò)25°C， 生物墨水也會(huì)加熱到25°C以上 粘度降低,，當(dāng)擠出時(shí)觀察到 即使在低壓下也有很厚的細(xì)絲,。在這里面凱斯, 重復(fù) 臺(tái)階 3 至 返回 至 這個(gè) 溫度范圍 對(duì)于 好打印適性。
注意：如果擠壓間隔時(shí)間過(guò)長(zhǎng) 生物墨水 罐頭 干的 在 這個(gè) 噴嘴 造成 它 至 木屐,。 如果 這個(gè)發(fā)生, 替換 與 新建 噴嘴,。 | |
| - 生物穿孔器 （BIO X、BIO X6或 可墨水 | |||
| 系列） | |||
| - 嗯 板材 或 Petri 碟子 |
表1.使用稀釋/未稀釋生物油墨在20-25°C下打印連續(xù)長(zhǎng)絲的建議最小擠壓壓力**(±2 kPa）,。“稀釋”假設(shè)一份PBS到十份bioink的混合物,，這是對(duì)bioink和細(xì)胞懸浮液混合條件的模擬。對(duì)于較小的稀釋度,，壓力需要增加到用于未稀釋生物墨水的壓力,。
**這只是推薦的啟動(dòng)壓力參考值。所需的實(shí)際壓力將根據(jù)制備程序（生物墨水的量和生物墨水的實(shí)際溫度）以及活塞在墨盒中的安裝和打印表面的平整度而變化,。該表是在打印頭溫度為24°C和使用PBS稀釋10+1生物墨水的情況下生成的,。
| 步驟 | 標(biāo)題 | 材料 | 說(shuō)明 |
| 5 | 交聯(lián) |
- 交聯(lián)劑和/或 - 用于光固化的405 或 365 nm 光模塊 - 細(xì)胞培養(yǎng)基 |
GelXA層狀油墨可以使用以下方法進(jìn)行光交聯(lián) 這個(gè) 405 或 365 納米 光 模塊 或 離子地用CaCl交聯(lián)2-含交聯(lián) 探員,。 如果 使用 兩者都有, 開(kāi)始 與 光交聯(lián)。光交聯(lián) 僅限 威爾 生成 a 較硬 結(jié)果比 離子型 交聯(lián) 只有,。
- 光交聯(lián)： 參見(jiàn) 表 2 下面 對(duì)于 推薦交聯(lián)時(shí)間,。確保 生物打印GelXA層狀連接構(gòu)建體是在打印后通過(guò)冷卻 打印床（如果使用BIO X 或BIO X6)或 放置 這個(gè) 打印 基材 與 這個(gè)在冰上構(gòu)造10秒（如果使用 可噴墨系列）。如果光交聯(lián)過(guò)程中 生物打印, 設(shè)置 這個(gè) 交聯(lián)參數(shù)適當(dāng)?shù)?/span> 在 這個(gè) G碼 對(duì)于 這個(gè) 可噴墨系列或打印頭設(shè)置頁(yè)面 對(duì)于 這個(gè) 生物 X 或 生物 X6.
注意：建議使用405納米光模塊 取而代之的是的 365 納米 一個(gè) 如果 有可能,。 過(guò)度曝光 可能損壞 這個(gè) 細(xì)胞,。
注： 至 驗(yàn)證 這個(gè) 交聯(lián) 是 足夠, 添加 37°C 媒體至 一個(gè) 打印 嗯 而且 觀察 那個(gè)它 不 溶解。 - 離子型 交聯(lián)： 淹沒(méi) 這個(gè) 充滿細(xì)胞的交聯(lián)溶液中的結(jié)構(gòu)物30 秒到5分鐘,，具體取決于結(jié)構(gòu) 大小,。除去交聯(lián)液并沖洗 構(gòu)造 與 基礎(chǔ)的文化 媒體 一次。 |
表2.建議的構(gòu)建光交聯(lián)時(shí)間***,。使用BIO X或BIO X6光固化模塊將每個(gè)光模塊的距離設(shè)置為5厘米,。如果使用可噴墨系列光固化模塊，所需時(shí)間可能會(huì)減少,。用其他參數(shù)交聯(lián),，見(jiàn)光交聯(lián)優(yōu)化協(xié)議。該表是使用GelXA LAMININK與間充質(zhì)干細(xì)胞生成的,。使用細(xì)胞打印時(shí),，曝光時(shí)間不要超過(guò)120秒。為了在打印較厚的構(gòu)造時(shí)達(dá)到最佳的結(jié)構(gòu)完整性,，建議每隔4層用365/405nm光施加3/5秒的光交聯(lián),。若在25°C以上使用bioink，每隔一層用365/405nm的光進(jìn)行3/5s的光交聯(lián),，效guo好,。
| 365牛米，搭接 0.25% | 405牛米,，搭接 0.25% | |
| 施工深度(mm)/時(shí)間(s) | 1/5 | 1/10 |
| 3/20 | 3/30 |
***這只是一個(gè)推薦的參考交聯(lián)時(shí)間開(kāi)始,。交聯(lián)所需的實(shí)際時(shí)間將根據(jù)結(jié)構(gòu)物的尺寸和溫度以及光固化模塊的強(qiáng)度和到結(jié)構(gòu)物的距離而變化。
| 臺(tái)階 | 標(biāo)題 | 材料 | 說(shuō)明 |
| 6 | 孵化 | -細(xì)胞培養(yǎng)基 |
- 交聯(lián)后,，將所需介質(zhì)加入構(gòu)造 而且 地點(diǎn) 他們在 一個(gè) 孵化器,。 - 在細(xì)胞培養(yǎng)基中孵育構(gòu)建物 標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件 (37°C，5%CO2而且95% 相對(duì)的 濕度） 或根據(jù) 至 應(yīng)用程序,。 |