圖3. PBT/NO/Pt在水溶液中的表征

鑒于 PNC11BA 出色的 1064 nm 消光系數(shù)和 PNC11BA NPs 明亮的 NIR-II 熒光,，研究者利用它們制備光療劑。PNC11BA 側(cè)鏈上的 PBA 基團很容易通過供體-受體配位負載順鉑 (CDDP) 和 NO 供體(DETA NONOate),。如圖 3a 所示,，通過常規(guī)沉淀實現(xiàn)了 PNC11BA,、CDDP、DETA NONOate,、DMPC 和DSPE-PEG2000-cRGD 的自組裝,，得到了多功能光療納米粒子 (稱為 PBT/NO/Pt)。CDDP 被負載在這些納米粒子上作為化療藥物和 NOX 活性 O2•?發(fā)生器,。DETA NONOate 被選為 pH 響應(yīng)的 NO 供體,。制備了僅負載DETA NONOate 或 CDDP 或不負載 DETA NONOate 和 CDDP 的 PNC11BA NPs 作為對照（表示為 PBT/NO、PBT/Pt 和 PBT）,。動態(tài)光散射 (DLS) 表明 PBT/NO/Pt 的流體動力學(xué)直徑 (Dh) 為 66.64 nm,，PDI低至 0.176（圖 3b）,。所得 PBT/NO/Pt 具有球形納米顆粒,，通過透射電子顯微鏡 (TEM) 測量其直徑為 80 nm（圖 3c）。能量色散 X 射線元素映射 (EDS) 顯示 Pt 元素在納米粒子中分布良好,，表明 CDDP 負載成功（圖 3d）,。根據(jù)微孔板讀數(shù)儀和電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICP-MS）獲得的不同濃度的標準曲線，計算出DETA NONOate 和 CDDP 在 PBT/NO/Pt 中的負載效率分別為 5.42% 和 3.18%,。

如圖 3e 所示,，水溶液中的 PBT/NO/Pt 在 800-1350 nm 處表現(xiàn)出強烈的 NIR 吸收，在 1064 nm 處的消光系數(shù)為 1.195 L g-1 cm-1,。在水溶液中 808 nm 光激發(fā)下,，PBT/NO/Pt 顯示出強烈的 NIR-II 熒光，中心位于 1101 nm,，長尾延伸至 1350 nm（圖 3f）,。NIR-II FL 強度在 60 分鐘內(nèi)幾乎保持恒定（808 nm，0.5 W cm-2）,，表明 PBT/NO/Pt 具有光穩(wěn)定性,。圖 3g 顯示了不同濃度下 PBT/NO/Pt 的 NIR-II PA 圖像。NIR-II PA 信號與 NPs 濃度表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系（圖 3h）,。在 1064 nm 激光輻照（1.0 W cm?2）下驗證了 PBT/NO/Pt 的光熱性能,。如圖 3i 所示，水溶液的溫度隨 PBT/NO/Pt 濃度的增加而升高,。例如,，在 0.1 mg mL?1 PBT/NO/Pt 下，溫度在 6 分鐘內(nèi)升高到 53 °C,，PCE 計算為53.65%,。此外，還忠實證明了 PBT/NO/Pt 在光熱作用下的穩(wěn)定性,，在五次光開/關(guān)照射循環(huán)中,，PBT/NO/Pt 溶液的溫度變化小于 2 °C（圖 3j）,。

接下來探索了 PBT/NO/Pt 中 DETA NONOate 和 CDDP 的酸響應(yīng)釋放曲線。使用典型的 Griess 測定法來量化 pH 7.4 和 pH 5.5 水溶液中 DETA NONOate 的釋放,。如圖 3k 所示,，在 pH 7.4 下，90 分鐘后PBT/NO/Pt 中 NO 的生成量最小,。相反,，在 pH 5.5 下，90 分鐘后 NO 釋放量超過 60 µm,，反映了 DETA NONOate 和 PBA 基團之間供體-受體配位相互作用在酸反應(yīng)下解離以及 DETA NONOate 降解,。在酸反應(yīng)下從 PBT/NO/Pt 中釋放 CDDP 是此設(shè)計中的關(guān)鍵步驟，因為 CDDP 只能在弱酸性細胞內(nèi)環(huán)境中激活 NOX 產(chǎn)生 O2•?,。通過 ICP-OES 評估了 PBT/NO/Pt 中 CDDP 的釋放情況（圖 3l）,，結(jié)果表明 pH 值為 7.4 時，90 分鐘后 CDDP 釋放量可忽略不計,，而 pH 值為 5.5 時,，由于氨基和 PBA 基團的加速解離，CDDP 釋放量超過 60%,。這些結(jié)果表明,，PBT/NO/Pt 中不利的 DETA NONOate 和 CDDP 泄漏在血液循環(huán)過程中可能受到限制，從而支持 NO 和 CDDP 在酸性腫瘤組織和癌細胞中的靶向釋放,。

圖4. 細胞內(nèi)生成 NO,、O2•? 和 ONOO?

圖 4a 顯示了細胞內(nèi) NO、O2•?和 ONOO?的產(chǎn)生方式,。首先通過共聚焦激光掃描顯微鏡 (CLSM) 和流式細胞術(shù)檢查 PBT/NO/Pt 的細胞攝取情況,。與載有 FITC 染料的 PBT/NO/Pt 孵育 1.5 小時后，在 SKOV3/DDP 細胞中發(fā)現(xiàn)大量綠色熒光,。孵育時間延長至 3 小時后觀察到更強的綠色熒光,，表明 PBT/NO/Pt 進入細胞（圖 4b）。鑒于已證實酸觸發(fā)的 NO 生成和 CDDP 釋放,，隨后監(jiān)測細胞內(nèi) NO,、O2•?和原位 ONOO?形成。使用商用 NO 熒光探針(DAF-FM DA) 評估細胞內(nèi) NO 水平,。如圖 4c 所示,，SKOV3/DDP 細胞與 PBT/NO/Pt 和 PBT/NO 孵育 3 小時后，由于DETA NONOate 在酸的作用下分解,，觀察到更強的綠色熒光,。相比之下，PBT/Pt 和 PBT 處理的 SKOV3/DDP 細胞和對照表現(xiàn)出非常弱的熒光，表明這些納米顆粒沒有產(chǎn)生 NO,。CDDP 在酸性細胞內(nèi)環(huán)境中釋放,，然后催化 NOX s產(chǎn)生 O2?。作者使用O2•?探針二氫乙錠 (DHE) 監(jiān)測了 SKOV3/DDP 細胞中的細胞內(nèi) O2•?水平,。如圖 4d 所示,，在PBT/NO/Pt 和 PBT/Pt 處理的SKOV3/DDP 細胞中觀察到明顯的紅色熒光 (O2•?)，表明細胞內(nèi) O2•?生成效率高,。然而,，由于缺乏 CDDP，在 PBT/NO 和 PBT 處理的SKOV3/DDP 細胞和對照中未檢測到紅色熒光,。NO 和 O2•?結(jié)合產(chǎn)生 ONOO?,，因此，使用商業(yè)探針 BBoxiProbe O71 測量細胞內(nèi) ONOO?,。如圖 4e 所示,，與 PBT/NO 和PBT/Pt 一起孵育的 SKOV3/DDP 細胞分別由于缺乏 O2•?和 NO 而未顯示出明顯的綠色熒光。正如預(yù)期的那樣,，在與 PBT/NO/Pt 一起孵育的 SKOV3/DDP 細胞中觀察到了綠色熒光,，表明通過原位產(chǎn)生 NO 和 O2•?產(chǎn)生了豐富的 ONOO?,。通過流式細胞分析進一步定量統(tǒng)計研究了PBT,、PBT/NO/Pt、PBT/NO和PBT/NO/Pt處理的SKOV3/DDP細胞內(nèi)NO,、O2•?和ONOO?的生成情況（圖4f,，g），這與上述CLSM成像結(jié)果一致,。

圖5. 體外評價PBT/NO/Pt在SKOV3/DDP細胞中的抗癌活性及機制

PBT/NO/Pt 引發(fā)癌細胞中 NO,、O2•?和 ONOO?的形成。通過甲基噻唑基四唑 (MTT) 測定法測試了 PBT/NO/Pt 在 SKOV3/DDP 細胞中的抗癌作用,。如圖 5a 所示,，PBT 處理組的細胞存活率略有下降。相反,，在 100 µg mL?1下,，PBT/Pt、PBT/NO 和 PBT + 激光處理的 SKOV3/DDP 細胞中的存活率分別下降至 79.1%,、64.3% 和 49.8%,。在所有組中，1064 nm 激光（6 分鐘,，1.0 W cm?2）處理的 PBT/NO/Pt 組表現(xiàn)出抑制作用（細胞存活率下降至 13.38%）,，證明了 PBT/NO/Pt 中 NIR-II PTT 和 ONOO?的優(yōu)異協(xié)同作用。還通過流式細胞術(shù)分析了 PBT/NO/Pt 誘導(dǎo)的細胞凋亡和壞死（圖 5b），結(jié)果表明 PBT/NO/Pt + 激光組的細胞毒性,，高凋亡率,，約為 87%,。相反,，PBT/NO,、PBT/Pt 和 PBT + 激光僅誘導(dǎo)中等程度的細胞凋亡,。這些結(jié)果表明 PBT/NO/Pt 通過共遞送 NO 和 CDDP 以及原位生成ONOO?在 SKOV3/DDP 細胞中具有有效的抗癌活性（圖 5e）,。

為了直觀地了解 PBT/NO/Pt 的治療效果，通過 JC-1 染色評估了線粒體損傷,。共聚焦成像和定量分析顯示,，PBT/NO/Pt + 激光治療組出現(xiàn)了最亮的綠色熒光,，表明線粒體膜電位喪失,；流式細胞術(shù)也獲得了類似的結(jié)果（圖 5c,、f）,。PBT/NO/Pt + 激光組的細胞內(nèi) ATP 水平下降（約 30%），可能是由于線粒體功能受到抑制（圖 5h）,。使用 γ-H2AX（DNA 雙鏈斷裂的常規(guī)標記物）評估 PBT/NO/Pt 造成的 DNA 損傷程度,。在 PBT/NO/Pt + 激光細胞中觀察到最亮的綠色熒光，表明 CDDP-DNA 加合物有效形成,，ONOO?造成的 DNA 損傷更嚴重（圖 5d、g）,。隨后，在SKOV3/DDP細胞中探究了PBT/NO/Pt的治療機制,。早先有報道稱,，CDDP可以形成Pt-GSH復(fù)合物并減少CDDP-DNA加合物的生成,，從而誘導(dǎo)CDDP的解毒,。用ThioTracker Violet測量了PBT/NO/Pt形成ONOO?對SKOV3/DDP細胞內(nèi)GSH的影響,。在圖5i中,，在空白對照和PBT,、PBT/NO和PBT/Pt處理的SKOV3/DDP細胞中觀察到明亮的綠色熒光,。相比之下,，PBT/NO/Pt+激光處理的SKOV3/DDP細胞顯示出明顯較少的綠色熒光,，表明GSH含量損失。流式細胞術(shù)和定量分析也得到了類似的結(jié)果,，表明PBT/NO/Pt+激光降低了細胞內(nèi)GSH（圖5j）,。因此,，ONOO?下調(diào)細胞內(nèi) GSH，從而改善 CDDP 與靶DNA 的結(jié)合并促進癌細胞凋亡,。

通過蛋白質(zhì)印跡法研究了相關(guān)蛋白（Pro-caspase-3,、Bcl-2,、γ-H2AX和 GS）的表達（圖 5k,、l,、m）,。在用 PBT/NO/Pt 和 1064 nm 光處理的 SKOV3/DDP 細胞中，裂解的 caspase-3 表達顯著誘導(dǎo)，Bcl-2 下調(diào)，表明更多細胞開始凋亡（圖 5k、l）,。正如預(yù)期的那樣,，γ-H2AX和 GS 的表達與之前的結(jié)果一致，解釋了為什么PBT/NO/Pt + 激光照射會造成更嚴重的 DNA 損傷,。這些結(jié)果證實,，原位 ONOO?生成下調(diào)了細胞內(nèi) GSH，增加了 CDDP–DNA 加合物和裂解的 caspase-3 的水平,，從而促進了細胞凋亡,。

圖6. SKOV3/DDP 荷瘤小鼠體內(nèi) NIR-II FL、NIR-II PA 和光熱成像

研究了 PBT/NO/Pt 的體內(nèi)抗癌效率,。在體內(nèi)實驗之前,，通過 NIR-II FL 和 NIR-II PA 成像系統(tǒng)可視化了腫瘤部位的 PBT/NO/Pt 積累。SKOV3/DDP 腫瘤異種移植小鼠接受靜脈注射 PBT/NO/Pt（150 µL,，2.0 mg mL?1）,，并在注射后 0.1、6,、12,、24 和 36 小時獲取圖像。如圖 6a,、c 所示,，腫瘤部位的 NIR-II FL 和 NIR-II PA 信號在 6 小時時變亮，并在 24 小時達峰值,。通過上述實驗得出結(jié)論,，NIR-II FL 和 NIR-II PA 成像可以為 1064 nm 激光治療提供精確指導(dǎo)。圖 6b,、d 顯示了腫瘤部位的定量成像分析,，其中 NIR-II FL 和 NIR-II PA 中的成像強度分別比注射前高 7.3 倍和 9.4 倍，表明 PBT/NO/Pt 通過增強滲透性和保留 (EPR) 效應(yīng)在腫瘤部位積累,。注射后 24 小時,，獲得了腫瘤和主要器官的 NIR-II FL 和 NIR-II PA 圖像,。離體數(shù)據(jù)顯示，腫瘤部位積累的 PBT/NO/Pt 比其他組織（包括代謝器官）更多,。此外,，在注射 PBT/NO/Pt 后 24 小時對腫瘤部位進行了典型的體內(nèi)光熱成像（圖 6e、f）,。1064 nm 激光照射（1.0 W cm?2）后腫瘤溫度逐漸升高,，并在約 6 分鐘時達到峰值 53 °C。在用 PBS 治療的腫瘤小鼠中,，沒有檢測到明顯的體溫升高,。

圖7. 對SKOV3和SKOV3/DDP腫瘤小鼠的體內(nèi)腫瘤抑制作用

在兩種皮下腫瘤模型（SKOV3 和 SKOV3/DDP 異種移植裸鼠）中評估了 PBT/NO/Pt 的體內(nèi)癌癥抑制作用。荷瘤小鼠隨機分為六組：（I）對照組,、（II）PBT,、（III）PBT/Pt、（IV）PBT/NO,、（V）PBT + 激光和（VI）PBT/NO/Pt + 激光,。靜脈注射 PBS、PBT,、PBT/Pt,、PBT/NO 或 PBT/NO/Pt（150 µL，2.0 mg mL?1）后,，每 2 天監(jiān)測一次腫瘤大小,。注射后 24 小時，PBT + 激光和 PBT/NO/Pt + 激光組的腫瘤部位暴露于 1064 nm 激光（1.0 W cm?2）照射 6 分鐘,。如圖7a所示,，15 天后，與對照組（腫瘤體積增加 10.2 倍）相比,，PBT/Pt 表現(xiàn)出非常弱的抗癌效果（腫瘤體積增加 7.4 倍）,。PBT/NO 和 PBT + 激光組的腫瘤體積分別增加了 7.0 倍和 5.2 倍，表明單一 NO 氣體和 NIR-II PTT 療法比 PBT/Pt 提供更好的腫瘤生長抑制效果,。與此形成鮮明對比的是,，由于 Pt、NO 和 NIR-II PTT 以及ONOO?爆發(fā)的協(xié)同作用,，PBT/NO/Pt + 激光產(chǎn)生了腫瘤抑制能力,。15 天后，從每組中切除腫瘤并成像（圖 7b）,。還記錄了收集的腫瘤的重量和體積,。對照組、PBT組、PBT/Pt組,、PBT/NO組,、PBT+激光組和PBT/NO/Pt+激光組的平均腫瘤重量分別為1.16、1.12,、0.89,、0.80,、0.60和0.10 g,，證明了1064 nm激光照射后PBT/NO/Pt具有顯著的抑癌活性（圖7c）。圖7d-f說明了PBT/NO/Pt+激光對SKOV3/DDP荷瘤小鼠的突出癌癥抑制作用,。進一步檢測到第15天分離的SKOV3腫瘤中凋亡相關(guān)蛋白（Pro-caspase-3,、Bcl-2、γ-H2AX和GS）的表達（圖7g,、h,、i）。與之前的結(jié)果一致,，PBT/NO/Pt+激光下調(diào)了GSH,，導(dǎo)致更嚴重的DNA損傷，并抑制了腫瘤的生長,。

為了探索 PBT/NO/Pt 的腫瘤抑制能力,，通過蘇木精-伊紅 (H&E) 染色、末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 dUTP 缺口末端標記 (TUNEL) 染色,、免疫組織化學(xué) (Ki-67 抗體染色) 和 γ-H2AX 免疫熒光染色分析了組織切片,。如圖 7j 所示，PBT/NO/Pt + 激光誘導(dǎo)凋亡反應(yīng),、腫瘤抑制和 DNA 損傷,，驗證了 PBT/NO/Pt 的放大治療效果。這些結(jié)果表明,，PBT/NO/Pt 共同遞送的 CDDP 和 DETA NONOate 通過產(chǎn)生 ONOO? 以及 Pt,、NO 和 NIR-II PTT 的協(xié)同作用導(dǎo)致 DNA 損傷和細胞凋亡。

在這項工作中,，開發(fā)了一個光療平臺 PBT/NO/Pt,，并展示了臨床應(yīng)用潛力的幾個優(yōu)勢。共軛聚合物 PNC11BA 具有內(nèi)在的生物相容性,，可以通過合理設(shè)計聚合物主鏈實現(xiàn)生物降解性,。PBT/NO/Pt 對腫瘤微環(huán)境中表達的酸性和高 NOX 表現(xiàn)出優(yōu)異的選擇性和敏感性，有利于消除具有多藥耐藥性的癌癥,。 PBT/NO/Pt具有優(yōu)異的光穩(wěn)定性和膠體穩(wěn)定性,。

本文構(gòu)建了一種 NIR-II 光觸發(fā)多功能 ONOO? 納米發(fā)生器 (PBT/NO/Pt)，用于在 NIR-II FL/NIR-II PA 成像引導(dǎo)下進行協(xié)同 NIR-II PTT/化療/過氧亞硝酸鹽治療。PBT/NO/Pt 在 1064 nm 激光輻照下表現(xiàn)出強 NIR-II 吸收,、優(yōu)異的 NIR-II 熒光發(fā)射,、強烈的 NIR-II PA 信號和優(yōu)異的 PCE (η = 53.65%)。此外,，PBT/NO/Pt 到達腫瘤部位,，腫瘤微環(huán)境中的酸性和高濃度 NOX 使 NO 和 O2•? 同時釋放，隨后原位形成 ONOO?,。這種原位生成 ONOO? 通過下調(diào)細胞內(nèi) GSH 和增加 DNA 損傷對SKOV3/DDP 細胞具有顯著的抗癌作用,。體外和體內(nèi)研究表明，在 ONOO? 和化療增強的 NIR-II PTT 下,，PBT/NO/Pt 具有顯著的抗 SKOV3 和 SKOV3/DDP 腫瘤抑制作用,。因此，開發(fā)的 NIR-II 光激發(fā)多功能 ONOO?納米發(fā)生器是治療耐藥性腫瘤的一種有前途的策略,。

參考文獻

Sun P, Hu D, Chen P, et al. Anti‐Quenching NIR‐II Excitation Phenylboronic Acid Modified Conjugated Polyelectrolyte for Intracellular Peroxynitrite‐Enhanced Chemo–Photothermal Therapy[J]. Advanced Science, 2024: 2309446.