本文要點(diǎn)：七甲基菁染料可在近紅外(NIR)窗口進(jìn)行深層組織熒光成像,?；鶞?zhǔn)染料ZW800-1的小分子偶聯(lián)物已經(jīng)在人體上進(jìn)行了測試,。然而,，由于結(jié)構(gòu)中化學(xué)不穩(wěn)定的C4’-O-芳基連接物容易被生物親核試劑切割，ZW800-1偶聯(lián)物的長期成像方案的開發(fā)受到限制,。本文報告了一種模塊化的合成方法,，合成了新型的雙束縛兩性離子七甲基菁染料，染料為ZW800-1的結(jié)構(gòu)類似物,，但穩(wěn)定性大大提高,。這種雙束縛染料的NIR-I和NIR-II版本可以與蛋白質(zhì)結(jié)合，如單克隆抗體,，而不會導(dǎo)致熒光團(tuán)降解或染料堆積在蛋白質(zhì)表面,。該熒光抗體結(jié)合物在異種小鼠腫瘤模型中顯示出良好的腫瘤靶向性。雙束縛分子設(shè)計提供的增強(qiáng)的穩(wěn)定性將使新的活體近紅外熒光成像實驗成為可能,，并可能移植到人類身上,。近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS

在NIR-I(700-1000 nm)或NIR-II(10001700 nm)窗口中具有吸收和發(fā)射波長的熒光團(tuán)的在生物醫(yī)學(xué)成像方面具有很大的應(yīng)用潛力，因為近紅外光對皮膚和組織有相對較深的穿透能力,。幾十年來,，吸收/發(fā)射波長約為800 nm的臨床近紅外七甲川菁染料吲哚青綠(ICG)一直被用于光學(xué)成像和診斷(方案1)。雖然ICG被廣泛應(yīng)用,，但它的最終潛力是有限的,，因為其不能與靶向生物分子結(jié)合。一種商用NIR-I染料IRdye800CW,，分子中含有羧基和多個磺酸鹽,，使其可以生物偶聯(lián)且具有良好的水溶性。許多生物偶聯(lián)物已經(jīng)被制備并用于體內(nèi)成像性能的評估,。在某些情況下,，非目標(biāo)器官組織中不希望的染料或熒光生物結(jié)合物積累被觀察到,，這促進(jìn)了兩性離子染料的發(fā)展，因為其可以減少染料與生物表面的結(jié)合,。一個典型的例子是ZW800-1，它已經(jīng)用于不同類型的生物偶聯(lián)十多年,。其染料本身或小分子結(jié)合物是非常親水的,，通過腎臟從血液中迅速清除。ZW800-1與靶向癌癥組織的環(huán)-RGD肽基序的偶聯(lián)物,，已進(jìn)入臨床試驗,。也有越來越多的報告使用ZW800-1或結(jié)構(gòu)類似物標(biāo)記用于活體成像和組織學(xué)應(yīng)用的大分子，或生物材料,，如細(xì)胞表面,、水凝膠、納米顆粒,、3D打印生物復(fù)合材料或用于組織工程應(yīng)用的細(xì)胞外基質(zhì)生物聚合物,。對于這些大多數(shù)的應(yīng)用來說，一個必要的染料性能特性是熒光生物偶聯(lián)物的長期化學(xué)穩(wěn)定性,，這一要求突出了ZW800-1潛在的化學(xué)反應(yīng)問題,；即，由于生物親核試劑對染料的4‘-苯氧基進(jìn)行親核取代而導(dǎo)致的連接基團(tuán)斷裂(如方案1中的粉色箭頭所示),。將ZW800-1標(biāo)記的抗體或納米顆粒樣品在血清中孵育24小時的研究已經(jīng)觀察到熒光信號的大量損失,。在近生理條件下，各種生物親核試劑對染料的分子內(nèi)和分子間攻擊的可能性很大,。由于染料降解造成的熒光信號的損失為縱向?qū)嶒瀻砹瞬淮_定性（縱向?qū)嶒炛荚跍y量已標(biāo)記有染料的植入生物材料的長期降解或運(yùn)輸）,。

如方案1的頂部所示，本文開發(fā)了一種NIR-I菁染料的合成方法,，這類染料由兩個或四個側(cè)翼線性臂立體地屏蔽在平面染料的每個表面上,。方案1顯示了本文的重點(diǎn)：即一類性能大大增強(qiáng)的新型雙束縛和可偶聯(lián)的NIR-I和NIR-II七甲基菁染料。有關(guān)雙束縛染料的文獻(xiàn)包括幾個有機(jī)可溶的例子和一個水溶性分子,。但這些染料大多數(shù)都不在近紅外區(qū)域發(fā)射,，也沒有一種是為水中的生物偶聯(lián)而設(shè)計的。本文通過制造穩(wěn)定的雙束縛的ZW800-1解決了其的降解問題,，稱之為dsZW800-1,。此外，通用的合成方法提供了雙束縛的NIR-II熒光染料dsZW1015,，其吸收/發(fā)射zui大值>1000 nm,，生成了dsZW1015標(biāo)記的抗體結(jié)合物，并成功地用于對小鼠腫瘤進(jìn)行體內(nèi)NIR-II熒光成像,。

方案1

實驗結(jié)果：

1.dsZW800-1的合成

dsZW800-1的合成如方案2所示,。合成的關(guān)鍵中間體是未束縛染料3,，它是在溫和的條件下用苯酚2取代前體1中的4‘-氯原子組裝而成的，其中2的結(jié)構(gòu)上帶有兩個含有末端疊氮基的附加臂,。隨后通過皂化反應(yīng)將3轉(zhuǎn)化為無束縛染料4,，然后在銅的催化下發(fā)生疊氮-炔環(huán)加成反應(yīng)共價連接兩條側(cè)翼帶，以62%的產(chǎn)率合成了dsZW800-1,。

方案2

2.dsZW800-1的分子結(jié)構(gòu)

用標(biāo)準(zhǔn)波譜方法對所有化合物的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征,。ZW800-1和未束縛染料4的化學(xué)位移非常匹配，表明二者分子構(gòu)象相似,。相比之下,，dsZW800-1的光譜包括多次甲基質(zhì)子的特定高場化學(xué)位移，指示兩條側(cè)翼帶中的三唑環(huán)的空間磁屏蔽,。dsZW800-1的X射線晶體結(jié)構(gòu)也證實了這種分子內(nèi)屏蔽效應(yīng)(圖1),。通過與文獻(xiàn)報道的具有4‘-苯氧基取代基的七甲基菁的晶體結(jié)構(gòu)的比較，揭示了dsZW800-1中兩條側(cè)鏈引起的兩個獨(dú)te的結(jié)構(gòu)特征,。一個特征是4‘-苯氧基環(huán)相對于七甲基菁熒光團(tuán)的取向,。通常情況下，4‘-苯氧基環(huán)的縱軸遠(yuǎn)離七甲基菁的垂直面,，但在dsZW8001中,，4’-苯氧基環(huán)被側(cè)翼帶強(qiáng)迫與垂直的七甲基菁環(huán)對齊，并將其面朝染料的一端旋轉(zhuǎn),。另一個獨(dú)te的結(jié)構(gòu)特征是分子內(nèi)晶格堆積距離,。通常情況下，七甲川菁染料表現(xiàn)出聚次甲基熒光團(tuán)的滑動同面堆積,，典型的分子間距離約為3.5-5.0 ?,。但dsZW800-1的側(cè)翼條帶增加了每個分子的空間隔離，相鄰熒光染料之間的分子間固態(tài)距離為~9 ?,。因此,，即使dsZW800-1的多個拷貝在自聚集條件下被迫聚集在一起，側(cè)翼條帶也確保了足夠的空間分離,，以防止染料轉(zhuǎn)移偶極的強(qiáng)烈耦合,。

圖1

3.dsZW800-1的光譜性質(zhì)和穩(wěn)定性

表1中染料光物理性質(zhì)的比較表明，與ZW8001相比,，dsZW800-1中的兩條側(cè)翼帶并沒有顯著改變zui大吸收和發(fā)射波長或熒光峰寬度,。有趣的是，dsZW800-1在PBS中的熒光量子產(chǎn)率(11.0%)明顯高于形式上為結(jié)構(gòu)異構(gòu)體的未束縛熒光團(tuán)4的熒光量子產(chǎn)率(8.1%),。這一差異表明,，dsZW800-1中的約束側(cè)翼帶更有效地抑制了從染料激發(fā)態(tài)到周圍水化殼層的非輻射能量轉(zhuǎn)移，這通常是高共軛近紅外染料在水中的主要能量弛豫途徑,。

接著進(jìn)行光漂白實驗量化ZW800-1,、4和dsZW800-1的光穩(wěn)定性,，即使用帶有620 nm長通濾光片的氙燈照射PBS中的不同染料溶液，并將漂白曲線擬合為單相指數(shù)衰減(圖2),。光穩(wěn)定性的測定順序為4>dsZW800-1>ZW800-1,。七甲基菁染料的主要光漂白途徑是光生單線態(tài)氧與多次甲基熒光團(tuán)的雙分子反應(yīng)，其次是鍵的斷裂和非熒光羰基片段的形成,。ZW800-1的相對較差的光穩(wěn)定性與親電單重態(tài)氧和具有給電子體4‘苯氧基取代基的七甲基菁化合物的高反應(yīng)性一致,。4和dsZW800-1的相對增強(qiáng)的光穩(wěn)定性歸因于近端線性臂或帶提供的空間位阻屏蔽效應(yīng)，這可能降低氧的光敏化效率和/或抑制隨后與單重態(tài)氧的雙分子反應(yīng),。

表1

圖2

繼續(xù)評價每種染料的化學(xué)穩(wěn)定性，將染料與1 mM谷胱甘肽(GSH)混合的溶液在pH 7.4的PBS緩沖液中孵育后,，進(jìn)行一系列光譜實驗,。GSH中的親核性的硫醇取代七甲基菁的對苯氧基很容易跟蹤，因為該反應(yīng)在七甲基菁的吸光度中產(chǎn)生了明顯的紅移,。圖3a顯示的是GSH與ZW800-1反應(yīng)的化學(xué)產(chǎn)物,。圖3b中的曲線圖比較了這三種染料在含有1 mM GSH的pH 7.4的PBS緩沖液中的穩(wěn)定性。未束縛的染料ZW800-1和4的半衰期(t1/2)分別為7.1分鐘和27分鐘,。相比之下,，dsZW800-1與1 mM GSH孵育10小時后，吸收光譜沒有變化,，表明沒有發(fā)生化學(xué)反應(yīng)(由質(zhì)譜儀證實),。由于某些細(xì)胞內(nèi)的谷胱甘肽水平可以達(dá)到10 mM，將dsZW800-1樣品與10 mM GSH孵育10小時,，仍然沒有證據(jù)表明dsZW800-1有任何降解,。這種對GSH攻擊的保護(hù)有效地證明了dsZW800-1中的兩條側(cè)翼帶可以有效地完quan阻止生物親核試劑取代不穩(wěn)定的七甲基菁4‘苯氧基。

圖3

4. 利用dsZW800-1進(jìn)行抗體標(biāo)記

谷胱甘肽引起的染料降解實驗表明,，未捆綁的ZW800-1和4應(yīng)當(dāng)不是蛋白質(zhì)標(biāo)記的良好選擇,，因為隨著時間的推移，不穩(wěn)定的七甲川菁4‘苯氧基會被蛋白質(zhì)表面的親核側(cè)鏈切割,，例如蛋白表面賴氨酸殘基的ε-氨基,。評估ZW8001和dsZW800-1用于蛋白質(zhì)結(jié)合的適宜性的實驗也證實了這一推斷。使用標(biāo)準(zhǔn)的酰胺鍵形成的化學(xué)方法將ZW800-1或dsZW800-1連接到山羊IgG抗體或牛血清白蛋白(BSA)上,。結(jié)果顯示,，與dsZW800-1結(jié)合的蛋白質(zhì)比與ZW800-1結(jié)合的蛋白質(zhì)產(chǎn)生更高的標(biāo)記度(DOL)，并且dsZW800-1標(biāo)記的蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度高3-4倍,。著眼于免疫球蛋白偶聯(lián)物的穩(wěn)定性,，觀察到IgG-dsZW800-1的NIR信號比IgG-ZW800-1穩(wěn)定得多。已知的IgG-ZW800-1的化學(xué)降解是一個重大的技術(shù)限制,，而IgG-dsZW800-1的穩(wěn)定性大大增強(qiáng),。dsZW800-1有望作為一種穩(wěn)定的近紅外熒光標(biāo)簽,，用來進(jìn)行測量染料標(biāo)記細(xì)胞或生物材料的降解或運(yùn)輸?shù)目v向?qū)嶒灐?/span>

5. 使用dsZW800-1進(jìn)行活體成像

通過將dsZW800-1結(jié)合到Panitumab(Pan,一種針對EGFR陽性腫瘤的臨床單抗)上，評估dsZW800-1標(biāo)記抗體的體內(nèi)成像性能,。圖4a中Pan-dsZW800-1(DOL=3.1)的吸收光譜在772 nm處有一個相對較窄的峰,，其激發(fā)產(chǎn)生的熒光光譜與游離染料相同。沒有顯示出與dsZW800-1染料在抗體表面的H堆積所對應(yīng)的吸收峰藍(lán)移,，而染料的H堆積猝滅會染料的熒光,，并可能改變抗體的生物分布。此外,，Pan-dsZW800-1在4oC環(huán)境下15天的吸收光譜沒有變化,，這表明它與臨床上使用的重組Pan具有非常相似的儲存壽命。通過靜脈注射Pan-dsZW800-1在EGFR+JIMT-1(三陰性乳腺癌)荷瘤小鼠身上測試體內(nèi)成像性能,。使用商業(yè)活體成像站(IVIS)和NIR-I熒光成像設(shè)置觀察到特異性和高攝取率,，平均腫瘤與背景比(TBR)在注射后72小時約為8，肝臟信號可以忽略(圖4b,，4c),。注射后72小時處死小鼠，器官的NIR-I熒光成像證實了Pan-dsZW800-1具有很高的腫瘤特異性(圖4d,、4e),。

圖4

6. dsZW1015的合成

繼續(xù)將雙束縛七甲基菁改造為光譜范圍擴(kuò)大到在NIR-II區(qū)(1000-1700 nm)吸收和發(fā)射的熒光染料，以改善活體成像,。最近商用InGaAs相機(jī)的出現(xiàn)極大地促進(jìn)了NIR-II成像的研究,，但目前限制進(jìn)一步發(fā)展的一個因素是缺乏相對較小(MW<2000 Da)的親水性和兩性離子NIR-II染料，這些染料可以附著在靶向生物分子上,，如抗體或粘附體,，而不形成非熒光染料的H-堆積或改變靶向生物大分子的特異性。NIR-II染料廣泛的疏水表面積使得生產(chǎn)用于靶向生物成像的水溶性生物結(jié)合物非常具有挑戰(zhàn)性,。一種著ming的NIR-II花青染料FD-1080(方案1),，其結(jié)構(gòu)包括疏水的苯并[c，d]吲哚雜環(huán)作為末端單元,。在PBS溶液中,，FD-1080(及其結(jié)構(gòu)類似物)形成非熒光H-聚集體，因此必須將其配置成與血清蛋白的非共價絡(luò)合物,，或者包裝在自組裝膠束或脂質(zhì)體中用于體內(nèi)成像研究,。FD-1080的第二個功能缺陷是缺乏合適的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)。為了解決這兩個問題,，采用了方案3中所示的模塊化合成序列來制備雙束縛帶,、帶電平衡的NIR-II染料dsZW1015。關(guān)鍵的合成前體是七甲基菁5，它是以商品化試劑苯并[c,，d]吲哚-2(1H)-酮為起始的四步法制備的,。隨后的兩個步驟引入了可共軛的羧基，并產(chǎn)生了未束縛的七甲川菁7,，它被轉(zhuǎn)化為所需的雙束縛形式dsZW1015。值得注意的是,，方案3中列出的所有化合物的非平面結(jié)構(gòu)極大地促進(jìn)了柱層析的純化。

方案3

7. dsZW1015的光譜性質(zhì)

NIR-II染料本身具有較低的熒光量子產(chǎn)率,，dsZW1015在DMSO中的測量值為0.10%,，未束縛的異構(gòu)體7的熒光量子產(chǎn)率為0.11%，與文獻(xiàn)報道的非極性有機(jī)溶劑中的NIR-II染料相當(dāng),。在水中,，NIR-II熒光量子產(chǎn)率更低，但dsZW1015-1在PBS中的熒光量子產(chǎn)率(0.014%)是7的熒光量子產(chǎn)率(0.006%)的兩倍多。亮度的增加可能有兩個原因,。一個是NIR-II熒光團(tuán)對周圍水合球體的空間屏蔽增強(qiáng)(類似于上面的ZW800-1和4的比較),，第二個是染料自聚集方面的顯著差異,。吸收光譜表明，在PBS中,，未束縛的7在~850 nm處顯示出第二個藍(lán)移的非熒光的H聚集吸收帶，而雙束縛的dsZW1015僅在980 nm處以發(fā)射單體的形式存在,。

8.使用dsZW1015進(jìn)行活體成像

以dsZW1015的NHS酯為原料，制備DOL=1.2的Pan-dsZW1015結(jié)合物,。Pan-dsZW1015的吸收光譜只在1000 nm處顯示一個發(fā)光單體染料峰(圖5a),，沒有證據(jù)表明多個染料的H堆積，在4 oC下15天后光譜性質(zhì)也沒有變化。dsZW1015應(yīng)該目前是第yi個與生物大分子偶聯(lián)的兩性離子七甲川菁NIR-II染料。在JIMT-1小鼠腫瘤模型上評估pan-dsZW1015的成像性能,?；铙w全身NIR-II熒光圖像顯示,，由于附加的疏水性苯并[c,，d]吲哚類染料的影響,，初始肝臟信號很強(qiáng)(4小時和24小時),。盡管如此，在注射后72小時觀察到明顯的腫瘤靶向,，并且偏離目標(biāo)的信號非常低(圖5b和5c)。成像結(jié)果表明，dsZW1015是具有空間屏蔽和平衡電荷的良好結(jié)構(gòu)組合,，能夠產(chǎn)生具有特定靶向特性的標(biāo)記抗體,，用于活體對象的有效近紅外成像,。

圖5

結(jié)論：

綜上所述，本文驗證了雙束縛七甲川菁染料是一類新的高性能,、可偶聯(lián)的近紅外熒光團(tuán),。與基準(zhǔn)NIR-I染料ZW8001相比，雙束縛類似物染料dsZW800-1顯示出略高的熒光亮度,，更好的化學(xué)穩(wěn)定性和兩倍的光穩(wěn)定性,。在使用染料標(biāo)記抗體的熒光成像方面，dsZW800-1優(yōu)于ZW800-1,，并且將更適合于測量植入染料標(biāo)記生物材料的長期降解或運(yùn)輸?shù)目v向?qū)嶒?。值得注意的是，使用與ZW800-1密切相關(guān)的結(jié)構(gòu)的NIR-I七甲川菁染料的熒光探針越來越多，由于存在活性4‘-苯氧基,，每個熒光探針都可能有穩(wěn)定性限制,。在這種情況下,，都應(yīng)該直接制備這些NIR-I染料的雙束縛形式，以期改善穩(wěn)定性和成像性能,。模塊化合成方法的一個優(yōu)點(diǎn)是末端雜環(huán)可以直接變化,，如制備末端帶有苯并[c，d]吲哚雜環(huán)的雙束縛七甲基菁染料dsZW1015,，該末端苯并[c，d]吲哚雜環(huán)將吸收/發(fā)射波長擴(kuò)展到NIR-II區(qū)域,?？臻g屏蔽和平衡電荷的結(jié)構(gòu)組合抵消了dsZW1015中熒光團(tuán)帶來的疏水性增強(qiáng),，可以生成染料標(biāo)記的抗體,，用于活體小鼠腫瘤的有效NIR-II熒光成像,。未來的設(shè)計迭代可以在末端雜環(huán)中加入合適的官能團(tuán)，以生產(chǎn)這些雙束縛花青染料的生物響應(yīng)型版本,，用于下一代“turn-on"或“ratiometric"近紅外熒光探針的應(yīng)用拓展。

參考文獻(xiàn)

Li, D. H.; Gamage, R. S.; Oliver, A. G.; Patel, N. L.; Muhammad Usama, S.; Kalen, J. D.; Schnermann, M. J.; Smith, B. D., Doubly Strapped Zwitterionic NIR-I and NIR-II Heptamethine Cyanine Dyes for Bioconjugation and Fluorescence Imaging. Angew Chem Int Ed Engl 2023, e202305062.

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