本文要點(diǎn)：具有NIR-II窗口熒光發(fā)射的熒光探針由于其成像深度的增加而得到了廣泛的研究。然而,，目前報(bào)道的NIR-II熒光探針存在合成路線復(fù)雜,、熒光量子產(chǎn)率(QYs)低等缺點(diǎn),。在NIR-II探針的研制中可采用屏蔽策略來提高其量子產(chǎn)率，但目前這種策略僅用于對稱的NIR-II探針的設(shè)計(jì),，特別是那些基于苯并[1,2-c:4,5-c ']雙([1,2,5]噻二唑)(BBTD)骨架的探針,。本文報(bào)道了一系列基于屏蔽策略的不對稱NIR-II探針，這些探針具有合成路線簡單,、高合成率(90%以上),、高QYs和大斯托克位移等優(yōu)勢。進(jìn)一步使用D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)作為NIR-II熒光探針(NT-4)的表面活性劑,，以提高探針的水溶性,，得到TPGS-NT-4 NPs。體內(nèi)研究表明,，具有高QY(3.46%)的TPGS-NT-4 NPs可實(shí)現(xiàn)高分辨率的血管造影和有效的局部光熱治療,，同時(shí)具有良好的生物相容性。本文通過結(jié)合血管造影和局部光熱治療來提高腫瘤對納米光熱劑的吸收,，同時(shí)減少其對正常組織的損傷,。

背景：近紅外窗口（NIR；700-1700 nm）的熒光團(tuán)在腦血流和腫瘤微環(huán)境的探測中可以提供高對比度的圖像,。但NIR-I熒光團(tuán)（NIR-I,，700-900 nm）臨床應(yīng)用受到其穿透深度不足（約0.22 mm）的阻礙，NIR-II熒光團(tuán)（NIR-II,，1000-1700 nm）具有更深的穿透深度（約3 cm）,、更大的空間分辨率（約100 nm）和良好的信噪比（SBR）等特性，因此,，探針的激發(fā)波長從NIR-I到NIR-II的深色位移將提高探針的組織穿透深度,。

迄今，已報(bào)道的有機(jī)NIR-II探針根據(jù)其化學(xué)工程策略可分為兩大類：1）結(jié)構(gòu)與花青染料相似的NIR-II探針；2）基于BBTD的供體-受體-供體（D-A-D）熒光團(tuán),。有機(jī)NIR-II熒光團(tuán)往往由于其分子內(nèi)和分子間相互作用的堆積而導(dǎo)致熒光淬滅,，量子產(chǎn)率低?？梢酝ㄟ^提高空間位阻來防止聚集進(jìn)而提高量子產(chǎn)率，如采用屏蔽策略,。屏蔽策略指的是添加一個(gè)官能團(tuán),，使分子骨架扭曲，從而增加分子間空間位阻,，減少分子內(nèi)和分子間的相互作用,，進(jìn)而減少分子激發(fā)態(tài)向周圍水分子的能量轉(zhuǎn)移。Dai的研究小組引入了通過交替屏蔽單元,、電子給體和受體設(shè)計(jì)的具有更高QY的NIR-II探針,。噻吩及其衍生物EDOT近年來也常常用于探針的設(shè)計(jì)，可作為熒光團(tuán)的第二給體以及橋接基團(tuán),。值得注意的是,，EDOT被證明在獲得適當(dāng)?shù)姆肿踊兒突谄帘尾呗蕴岣逳IR-II熒光團(tuán)的QYs方面優(yōu)于噻吩。本文分別使用噻吩和EDOT作為第二給體和橋接分子來構(gòu)建NT-1和NT-2熒光團(tuán),。結(jié)果顯示NT-2與EDOT在DCM中的QY為6.31%,，比NT-1(Scheme 1)高1.8倍。

Scheme 1

另一種提高QY的創(chuàng)新策略是電荷屏蔽效應(yīng),，即通過引入兩性離子電荷來減少分子的凈電荷,。還可以通過疏水或疏水分支屏蔽熒光團(tuán)的分子結(jié)構(gòu)來減少熒光團(tuán)與水分子之間的相互作用。本文在熒光團(tuán)的設(shè)計(jì)中采用疏水受體（1,8-萘內(nèi)酰亞胺）來達(dá)到上述目的,。同時(shí),，1，8-萘內(nèi)酰亞胺還可以有效地將熒光紅移到NIR-II窗口,。雙鍵的增加也有利于π-共軛體系的拓展,，本文通過增加橋聯(lián)雙鍵來進(jìn)一步使熒光團(tuán)的發(fā)射紅移，并得到了熒光團(tuán)NT-3和NT-4（Scheme 1）,。

此外,，構(gòu)建高產(chǎn)、合成簡單,、副產(chǎn)物少的的NIR-II探針對于臨床轉(zhuǎn)化是很重要的,。與以往報(bào)道的對稱D-A-D NIR-II熒光團(tuán)相比，本研究設(shè)計(jì)的NIR-II熒光團(tuán)系列(NT-1,、NT-2,、NT-3、NT-4)的合成路線簡單,，產(chǎn)率超過90%,，且具有不對稱D-π-A結(jié)構(gòu),。根據(jù)已有的報(bào)道，不對稱結(jié)構(gòu)的能量遷移是部分可逆的,，這對于減少熒光團(tuán)的光漂白有利,。這也就進(jìn)一步賦予分子恰當(dāng)?shù)撵`活性和熒光強(qiáng)度/熒光持久范圍，以更好地滿足血管造影的需要,，并提供更好的空間分辨率和對比度,，以解決微血管分布和進(jìn)行灌注分析。

基于分子設(shè)計(jì)策略和實(shí)驗(yàn)結(jié)果,，NT-4被作為后續(xù)研究的候選物,。為了提高其溶解度和細(xì)胞滲透性，進(jìn)一步用TPGS（被FDA批準(zhǔn)的具有抗氧化和抗炎作用）包封NT-4,。TPGS使熒光團(tuán)具有隱身效果,。水中TPGS-NT-4 NPs的QY為3.46%，與已有報(bào)道的NIR-II探針的QY相比處于中上水平,，滿足NIR-II熒光成像的要求,。體內(nèi)血管造影實(shí)驗(yàn)顯示，TPGS-NT-4 NPs是一種有效的NIR-II成像探針,。尾靜脈注射TPGS-NT-4 NPs后,，裸鼠后肢血管的高斯半峰寬度(FWHM)為495 μm，濾光率為1300 LP, SBR為2.57,。此外,，通過右股動脈局部注射TPGS-NT-4 NPs可以很好地顯示腫瘤血管。

毫無疑問,，將納米藥物有效地輸送到腫瘤組織,，同時(shí)減少對正常組織的損傷是一項(xiàng)艱巨的挑戰(zhàn)。本研究通過結(jié)合血管造影和局部光熱治療來提高納米光熱劑對腫瘤的吸收,，同時(shí)減少其對正常組織的損傷,。在NIR-II熒光引導(dǎo)下局部注射TPGS-NT-4治療劑量，然后進(jìn)行光熱治療,。在輻照期間產(chǎn)生的健康組織損傷將大大減少,。H&E染色證實(shí)了TPGS-NT-4 NPs具有良好的生物相容性。隨后,，本文還研究了TPGS-NT-4 NPs的光熱性質(zhì),。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)TPGS-NT-4 NPs具有良好的光熱隔熱性能和優(yōu)異的光熱穩(wěn)定性。體內(nèi)光熱治療實(shí)驗(yàn)也進(jìn)一步證實(shí)TPGS-NT-4 NPs具有開發(fā)用于局部治療的光熱劑的潛力,。

實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：

1）探針的合成,、表征及光學(xué)性質(zhì)研究

通過選擇低電子密度受體(化合物10)和高電子密度給體(4-乙基- N, N -二甲基ben胺)，并以噻吩為橋接結(jié)構(gòu)，設(shè)計(jì)了探針NT-1的不對稱D-A結(jié)構(gòu),。NT-1的合成通過一個(gè)簡單的過程完成(圖1A),。合成反應(yīng)的產(chǎn)率為92%，與目前報(bào)道的NIR-II熒光探針相比,，收率非常高,。根據(jù)已報(bào)道的研究，采用屏蔽策略可以有效地提高NIR-II探針的QYs,，這是由于共軛主鏈阻礙了分子間相互作用或阻止了聚集,。據(jù)此，本文設(shè)計(jì)并合成了以EDOT取代噻吩的NT-2,。EDOT作為第二給體和橋接基團(tuán)具有扭曲分子骨架的作用,，從而降低分子間的相互作用,。NT-3和NT-4是通過延長雙鍵來獲得發(fā)射波長的紅移而得到的,。NT-2、NT-3,、NT-4的收率也較高,，分別為92%、90%,、91%,。用1H NMR、13C NMR和質(zhì)譜對這4個(gè)化合物進(jìn)行了表征,，證實(shí)了結(jié)構(gòu)的正確性,。

Figure 1

對NT-1、NT-2,、NT-3和NT-4的光學(xué)性質(zhì)進(jìn)行深入的研究,。如圖1A-D所示，四種小分子化合物在近紅外窗口均有吸收,，四種化合物在DCM中的max吸收波長分別為840,、860、880和915 nm,。此外,，隨著溶劑極性的增加，四種探針的紫外-可見吸光度都出現(xiàn)了顯著的藍(lán)移效應(yīng),。有趣的是,，在含有10% DMSO的水溶液中，這四種化合物的吸收都藍(lán)移到約650 nm,。推測光譜藍(lán)移是由于這四種化合物的水溶性差,，它們都是大的共軛體系，聚集在極性溶劑中。

隨后,，在808 nm光激發(fā)下,，四種探針的熒光發(fā)射都在NIR-II窗口，特別是在DCM和DMSO中(圖1E-H),。四種化合物單體的max熒光發(fā)射波長分別在1095,、1050、1130和1110 nm處,，而探針的低聚物在1200 nm處有一個(gè)肩峰,。具有大斯托克斯位移的探針在生物成像中具有更高的信噪比(SBR)，四種化合物的Stokes位移分別為287,、242,、322和302 nm。本文還簡要分析了四種分子結(jié)構(gòu)的LUMO和HOMO軌道,。四種探針的HOMOs均沿共軛主鏈離域,，而LUMOs主要位于受體上。與NT-1和NT-3相比,，含有EDOT的探針(NT-2和NT-4)表現(xiàn)出較少的離域LUMOs,，并且可以調(diào)節(jié)靜電勢能的分布(圖1B)。比較NT-2和NT-4,，NT-4的雙鍵延伸后吸收能降低,，因此其吸收有明顯的紅移趨勢，這與實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致,。以IR-26在1,2-二氯乙烷(DCE)中的含量為基準(zhǔn),，計(jì)算了四種探針的相對QY。NT-1,、NT-2,、NT-3和NT-4在DCM中的QY分別為3.48%、6.31%,、2.75%和4.08%,。值得注意的是，在相同的測試條件下,，由于引入了EDOT, NT-2和NT-4的熒光強(qiáng)度要高于NT-1和NT-3,。產(chǎn)生這種實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的原因可能是由于EDOT的扭曲結(jié)構(gòu)減少了分子間的相互作用?；谒姆N探針的光學(xué)性質(zhì),，本文選擇NT-4作為研究對象，對這種結(jié)構(gòu)不對稱的NIR-II探針進(jìn)行進(jìn)一步的修飾和研究,，得到TPGS-NT-4 NPs,，其熒光量子產(chǎn)率處于中等以上水平,。

2）TPGS-NT-4 NPs的制備、表征及性能研究

由于NT-4的水溶性較差,，選擇兩親性生物材料D-α-生育酚基聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)對探針進(jìn)行包封,，使其具有生物學(xué)應(yīng)用價(jià)值。通過薄膜水合法制備了負(fù)載NT-4的納米顆粒(TPGS-NT-4 NPs),，并通過透析去除未包封的NT-4,。接著對TPGS-NT-4的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征，并對其理化性質(zhì)進(jìn)行了研究,。如圖2A所示,，TPGS-NT-4 NPs的粒徑約為15.37 nm，納米顆粒呈電中性,。通過透射電鏡(TEM)表征了TPGS-NT-4 NPs的形態(tài)和大小,。納米顆粒呈球形，具有光滑均勻的形貌(圖2D),。TPGS-NT-4 NPs的max紫外可見吸收波長為805 nm,。圖2B顯示，TPGS-NT-4 NPs與NT-4在DMSO中的紫外-可見吸收相似,。這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象證明,，TPGS的包封顯著提高了NT-4的水溶性,。TPGS-NT-4 NPs的納米包封率為84%,。TPGS-NT-4 NPs的max熒光波長為1020 nm，以IR-26為標(biāo)準(zhǔn)測定的QY為3.46%(圖2C),。TPGS-NT-4 NPs的Stokes位移為212 nm,。同時(shí)，對納米顆粒的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,。如圖2E和F所示,，室溫下放置15天后，TPGS-NT-4 NPs的溶液狀態(tài),、紫外可見吸收光譜和納米顆粒大小均無顯著差異,，表明TPGS-NT-4 NPs在室溫下具有良好的穩(wěn)定性。

Figure 2

3）TPGS-NT-4 NPs的NIR-II血管成像研究

首先,，通過MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了NT-4和TPGS-NT-4 NPs在高濃度下對細(xì)胞沒有毒性,。為了證明TPGS-NT-4 NPs可以作為一種新的NIR-II探針用于全身血管成像，對Balb/c裸鼠進(jìn)行全身和腦血管成像,。裸鼠靜脈注射TPGS-NT-4 NPs (200 μL, 0.5 mg/mL) (n = 3),。采用不同濾光片(900 LP、1000 LP,、1100 LP,、1300 LP),，通過InGaAs相機(jī)記錄裸鼠NIR-II圖像。注射TPGS-NT-4 NPs后10分鐘顯示NIR-II血管成像,。為了更好地評價(jià)TPGS-NT-4 NPs血管成像效果,，本研究選擇對腿部血管進(jìn)行局部血管成像。如圖3A和B所示,，在相同的曝光時(shí)間(400 MS)下,，TPGS-NT-4 NPs在NIR-II窗口1300 LP下的成像分辨率更高。同時(shí),，對高斯半頻全寬(FWHM)和信噪比(SBR)進(jìn)行分析,。當(dāng)濾波器為1100 LP時(shí)，后肢血管的FWHM為643 μm,，而當(dāng)濾波器為1300 LP時(shí),，后肢血管的FWHM為495 μm(圖3C和D)。此外,，當(dāng)濾波器為1300 LP時(shí),，SBR為2.57，顯著高于濾波器為1100 LP時(shí)的1.53,。隨后,，在與腿部血管相似的條件下對裸鼠的腦血管進(jìn)行成像(圖3E和F)。如圖3G和H所示,，F(xiàn)WHM分別為936 μm (1100 LP)和608 μm (1300 LP),。SBR分別為1.42 (1100 LP)和2.43 (1300 LP)。TPGS-NT-4 NPs在注射后24 h左右被代謝,。注射TPGS-NT-4 NPs后24 h,，對裸鼠(n = 3)進(jìn)行安樂和解剖，H&E染色分析不同臟器,。H&E染色分析實(shí)驗(yàn)顯示,，經(jīng)尾靜脈注射TPGS-NT-4 NPs對裸鼠各臟器無明顯損傷，證明TPGS-NT-4 NPs在體內(nèi)具有良好的生物相容性,。綜上所述,，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，TPGS-NT-4 NPs可以作為NIR-II窗口體內(nèi)血管成像的理想候選,。

Figure 3

4）TPGS-NT-4 NPs光熱性質(zhì)研究

雖然NIR-II成像可以增加成像深度,，但探針在NIR-II窗口內(nèi)的QYs仍然較低。根據(jù)雅布隆斯基圖理論,，NIR-II探針返回基態(tài)所吸收的能量大部分以非輻射形式釋放,。本文研究了TPGS-NT-4 NPs的光熱性質(zhì)。在808 nm激光照射下,，TPGS-NT-4 NPs的溫度變化(ΔT)隨著激光功率的增強(qiáng)而增大(圖4A),。當(dāng)激光功率密度為0.6 W/cm2時(shí),，溫度變化可達(dá)33.2℃。同時(shí),，納米顆粒的ΔT也隨著濃度的增加呈增加趨勢(圖4B),。為了證明光熱效應(yīng)是由包封藥物引起的，還研究了空殼納米粒子(TPGS NPs),。如圖4C所示,，TPGS- NT -4 NPs的光熱效應(yīng)明顯高于水和TPGS NPs。這些結(jié)果證明了NT-4包封探針產(chǎn)生的增溫效應(yīng),。同時(shí),，在相同光照條件下，NT-4在DMSO中的光熱性質(zhì)與TPGS-NT-4相似,。NT-4的光熱轉(zhuǎn)化率為43%,。紅外熱成像圖像進(jìn)一步證實(shí)了TPGS-NT-4 NPs良好的光熱性能,，如圖4E所示。最后,，對TPGS-NT-4 NPs的光熱穩(wěn)定性進(jìn)行了監(jiān)測,。如圖4D所示,，TPGS-NT-4 NPs在90 min (808 nm, 0.6 W/cm2)內(nèi)經(jīng)歷了三個(gè)光開關(guān)周期,，而top溫度沒有明顯變化,。計(jì)算TPGS-NT-4 NPs的光熱轉(zhuǎn)化率為45%。對比已報(bào)道的光熱劑,，TPGS-NT-4 NPs對NIR-II成像的光熱轉(zhuǎn)化率處于中上區(qū)間,。由此可見，TPGS-NT-4 NPs具有優(yōu)異的光熱性能,，有望開發(fā)為光熱治療劑,。

Figure 4

5）TPGS-NT-4 NPs光熱處理效果的體內(nèi)評價(jià)

建立4T1腫瘤小鼠模型,，來評價(jià)TPGS-NT-4 NPs作為光熱劑的治療作用,。腫瘤生長后，將實(shí)驗(yàn)小鼠隨機(jī)分為4組:對照組,、PBS加激光組,、TPGS加激光組、TPGS- NT -4 NPs加激光組(n = 3),。本文設(shè)計(jì)了一種局部光熱治療聯(lián)合血管造影的方法,，旨在提高TPGS-NT-4 NPs的腫瘤攝取，同時(shí)max限度地減少對正常組織的損傷,。本動物實(shí)驗(yàn)流程如圖5A所示,。首先，局部注射TPGS-NT-4 NPs (30 μL, 0.1 mg/mL)至腫瘤附近血管,。注射后10分鐘,，在近紅外二區(qū)對小鼠局部血管進(jìn)行成像,。如圖5A所示，局部注射部位(紅圈標(biāo)記)血管亮度顯著,，腫瘤(藍(lán)圈標(biāo)記)也呈現(xiàn)熒光,。這些結(jié)果表明，TPGS-NT-4 NPs通過血管向腫瘤方向積累,。然后對小鼠進(jìn)行光熱治療(PTT),，獲得小鼠的紅外熱像圖(圖5B)，注射TPGS-NT-4 NPs并進(jìn)行808 nm激光照射的小鼠,，腫瘤區(qū)域溫度明顯升高,，照射10 min后達(dá)到54.7°C的峰值，而注射nano殼或水的小鼠未觀察到明顯的加熱,。隨后,，對4T1腫瘤小鼠進(jìn)行10分鐘的激光照射。然后每2 d記錄不同治療組小鼠的體重和腫瘤大小,，連續(xù)14 d,。與對照組、激光照射PBS和激光照射TPGS相比,，注射TPGS- NT -4 NPs小鼠的腫瘤明顯縮小(圖5C),。為了觀察治療后腫瘤的差異，不同治療組的小鼠在治療周期結(jié)束時(shí)被安樂并解剖,。圖5E顯示,，經(jīng)TPGS-NT-4 NPs治療后，腫瘤明顯縮小甚至消失,。同時(shí),，在治療期間，相應(yīng)組小鼠的體重沒有顯著差異(圖5D),。不同組腫瘤的TUNNEL染色分析也顯示,，激光照射后TPGS-NT-4 NPs在組織水平上具有腫瘤殺傷作用(圖5F)。這些結(jié)果表明TPGS-NT-4 NPs具有出色的光熱處理效果,。

Figure 5

結(jié)論：本文報(bào)道了一系列具有不對稱D-A結(jié)構(gòu)的新型NIR-II探針(NT-1, NT-2, NT-3和NT-4),。利用噻吩結(jié)構(gòu)作為π橋合成了NT-1探針?；谟肊DOT代替噻吩的屏蔽策略設(shè)計(jì)了NT-2,。由于EDOT能夠扭曲主鏈的偶聯(lián)以及阻止分子間和分子內(nèi)的相互作用，NT-2的QY顯著增加,，約為NT-1的1.8倍,。進(jìn)一步擴(kuò)展NT-1和NT-2，得到了發(fā)射波長紅移的探針(NT-3和NT-4),。結(jié)果表明,，NT-1,、NT-2、NT-3和NT-4具有高QY和大Stokes位移等優(yōu)異的光學(xué)性能,。此外,，與報(bào)道的NIR-II探針相比，這四種探針的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是合成過程簡單,，產(chǎn)率高達(dá)90%左右,。隨后，本研究選擇NT-4進(jìn)行修飾和制備納米顆粒(TPGS-NT-4 NPs),。體內(nèi)血管造影實(shí)驗(yàn)顯示TPGS-NT-4 NPs在1300 LP下具有較高的分辨率和SBR,，證明TPGS-NT-4 NPs具有高分辨率的NIR-II成像引導(dǎo)血管造影的能力。NT-1,、NT-2,、NT-3和NT-4不僅擴(kuò)展了不對稱NIR-II探針的文庫，而且其簡單的合成和顯著的NIR-II成像特性也有利于它們的商業(yè)或臨床轉(zhuǎn)化,。此外,，TPGS-NT-4 NPs具有良好的光熱性能?；诰植窟f送和治療的優(yōu)勢,，在808 nm激光照射下局部注射TPGS-NT-4 NPs并血管造影后，腫瘤縮小甚至消融,。局部光熱療法聯(lián)合血管造影可以進(jìn)一步增加腫瘤攝取,，同時(shí)減少對正常組織的損傷。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步表明,，TPGS-NT-4 NPs有望成為血管造影和局部光熱成像的有效藥物,。

參考文獻(xiàn)

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