本文要點：基于稀土摻雜納米晶體(RENC)的短波紅外(SWIR,，1000-3000 nm)熒光生物成像具有更深的穿透深度和更高的清晰度，然而,，它們的降頻發(fā)射很少能在超過1600 nm外顯示足夠的亮度,，特別是在NIR-IIc中。本文提出了一類銩(Tm)自敏化RENC熒光探針,，它在1600-2100 nm(NIR-IIb/c)處顯示出明亮的降頻發(fā)光,，可用于活體生物成像。惰性外殼涂層蕞大限度地減少了表面猝滅,，并結(jié)合了強交叉弛豫,，允許LiTmF4@LiYF4納米粒子通過吸收800 nm(大斯托克斯位移~1000 nm，jue對量子產(chǎn)率~14.16%)或1208 nm(NIR-IIin和NIR-IIout)的近紅外光子來發(fā)射強降頻發(fā)射,。此外,，摻雜Er3+進行能量俘獲,，實現(xiàn)了四波長的近紅外輻射和明亮的NIR-IIb/c發(fā)射。我們的結(jié)果表明,，基于Tm3+的NIR-IIb/c納米探針具有高信噪比和清晰度,，為未來應(yīng)用和轉(zhuǎn)化到不同領(lǐng)域提供了新機會。近紅外二區(qū)小動物活熒光成像系統(tǒng) - MARS

短波紅外(SWIR,，1000-3000 nm),，也被定義為第二近紅外區(qū)(NIR-II)，在生理研究和生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中具有廣闊的應(yīng)用前景,。在這一區(qū)域,，超過1500 nm的發(fā)射被認為是另一個具有更高空間分辨率和更深成像深度的成像窗口。值得注意的是,，NIR-IIb(1600-1700 nm),、NIR-IIc(1700-2000 nm)和NIR-IId/NIR-III(2100-2300 nm)波段的長端顯示出低散射損失和接近于零的自發(fā)熒光，這進一步提高了空間分辨率,、信號背景比(SBR)和成像穿透深度,，以實現(xiàn)更好的生物成像清晰度。然而,，迄今為止,，發(fā)射超過1600 nm的NIR-IIb熒光/發(fā)光探針仍然非常有限，僅有報道尾部延伸至1600 nm的AIEgens和硫化鉛(PbS)/硫化鎘(CdS)量子點,。這些關(guān)鍵波長區(qū)域需要更多的具有高效率,、低細胞毒性、大斯托克斯位移和光穩(wěn)定性的清晰且更亮的探針,。

稀土摻雜納米晶體(RENC)由于其近紅外激發(fā)帶,、窄發(fā)射帶和上述其他所需的優(yōu)點，已成為理想的NIR-II成像納米探針,，在多路傳感,、時間門控檢測、成像引導(dǎo)治療和外科手術(shù)中具有巨大的潛力,。據(jù)報道,，有幾個離子在NIR-II區(qū)有發(fā)射，包括在1185 nm處的Ho3+,，1060 nm,，1310 nm處的Nd3+，1525 nm處的Er3+,，以及1450 nm處的Tm3+(圖1a),。Tm3+是少數(shù)幾種表現(xiàn)出從紫外到中紅外區(qū)域的不同光譜轉(zhuǎn)換的RE3+離子之一。通常報道的Tm3+在近紅外-II區(qū)的斯托克斯或下移發(fā)光(DSL)位于1450 nm(3H4→3F4,，弱躍遷),，顯示出低發(fā)光效率,，并在該區(qū)域與水強吸收競爭(圖1a)。因此,，這極大地限制了基于Tm的探針在NIR-II區(qū)域進行光學(xué)成像,。然而Tm3+的3F4→3F6躍遷顯示出從1600到2100 nm的強烈發(fā)射波段，通過進一步將穿透深度增加到亞厘米水平并消除自發(fā)熒光,，可以實現(xiàn)高對比度的深層組織成像(圖1a),。到目前為止，Tm3+(1600-2100 nm)的這種光譜特性主要用作塊狀激光玻璃的激光應(yīng)用的增益材料,，還沒有利用Tm3+的NIR-IIb/c區(qū)發(fā)射用于活體生物成像的報道,。這可能是由于在制備明亮的Tm摻雜納米顆粒過程中存在嚴重的濃度猝滅和表面猝滅，以及不適當?shù)拿艋瘎┧隆?/span>

在這里,，為了滿足NIR-IIb或NIR-IIc發(fā)射探針的要求,，本文shou次提出了用于活體生物成像的高摻雜Tm3+離子自敏化納米顆粒。在本研究的設(shè)計中,，Tm3+離子同時作為敏化劑和激活劑來吸收800 nm(近紅外-I)或1208 nm(近紅外-II)的光子,，由于這種輻射躍遷引起的強烈的交叉弛豫(CR)，它們產(chǎn)生了有效的1600-2100 nm斯托克斯發(fā)射(3F4→3H6),。此外,，還合理地摻雜了能量陷阱離子，如Er3+和Dy3+,，以介導(dǎo)Tm3+敏化的下移發(fā)射,。這些明亮的Tm納米粒子使得非侵入性深層組織成像能夠在SWIR窗口中以更高的質(zhì)量和清晰度研究生物相互作用。

研究內(nèi)容：在生物成像應(yīng)用之前,，首先系統(tǒng)地研究和比較了惰性/未摻雜殼層對重度摻雜Tm3+納米顆粒發(fā)光的影響,。補充圖1a和圖1c中的透射電子顯微鏡圖像表明，所得到的純LiTmF4核和Tm@Y核殼納米粒子(Tm-NPs)具有均勻的形貌,，平均尺寸分別為~9.8 nm×13.7 nm和~19.3 nm×24.8 nm(寬度×高度),。粉末X射線衍射分析表明，它們的表面形貌為四方的(I41/a)空間群,。Tm-NPs的衍射峰與四方LiYF4晶體的參考圖很好地對應(yīng),，表明形成了純相納米晶體(圖1d)。Tm-NPs的HAADF STEM圖像和元素映射結(jié)果進一步證實了它們的核-殼結(jié)構(gòu),，成分邊界清晰，產(chǎn)生了明亮的Tm3+核和深色的Y3+殼(圖1e),。

接著研究單一Tm摻雜的膠體納米晶體的發(fā)光性質(zhì),。Tm-NPs在環(huán)己烷溶液中的下轉(zhuǎn)移發(fā)光（DSL）為1600~2100 nm，這歸因于3F4→3H6在800 nm光照射下的躍遷,。由于Stark分裂的襯底具有3F4態(tài),，~1800 nm處的多波段發(fā)射光譜位于NIR-IIb/c區(qū),，適合NIR-II成像。然而,，與干燥的TM-NPs的全光譜(圖1a)相比,，作為溶劑的環(huán)己烷由于其自身的強NIR-IIc吸收而嚴重猝滅了1680-1900 nm附近的發(fā)光。

圖1

對于Tm3+的濃度介導(dǎo)的DSL,，在納米材料(僅核心)中也發(fā)生了嚴重的濃度猝滅,，但在LiYF4殼的外延生長之后，觀察到DSL強度的穩(wěn)定增加(圖2a),。電子填充過程可以解釋Tm-NPs的強濃度依賴性發(fā)光現(xiàn)象,，如圖2c所示。Tm3+離子通過激發(fā)電子直接敏化吸收800 nm光子,，并通過從3H4到3F4(1450 nm),，然后從3F4到3H6 (1600-2100 nm)的兩個連續(xù)輻射躍遷路徑填充3H4態(tài)。3H4與3F4能級和3F4到基態(tài)之間的能隙分別約為6850 cm?1和5890 cm?1,。這兩個緊密的能隙使得3H4→3F4和3H6→3F4躍遷之間能產(chǎn)生高效的Tm3+→Tm3+ CR,，這保證了更多被吸收的光子填充到中間3F4能級，然后躍遷到基態(tài)(3H6) 以增加NIR-II發(fā)射強度,。盡管3F4→3H6躍遷的發(fā)光單調(diào)增加,，但隨著Tm3+摻雜濃度從10%增加到40%，Tm-NPs的衰減時間逐漸減少,，隨著Tm3+摻雜濃度從60增加到100,，在1680 nm處的發(fā)射壽命可能由于尺寸差異而增加(圖2b)。1450 nm發(fā)射壽命進一步證明了3H4和3F4能級種群競爭的濃度依賴性,。隨著Tm3+濃度的增加,，發(fā)光強度進一步減弱，因為逐漸增加的CR抑制了3H4態(tài)的自發(fā)發(fā)射,，同時增加了3F4的數(shù)量,。LiYF4的殼層厚度從~ 1.7、2.8 nm增加到5.0 nm,，正如預(yù)期的那樣,，在800 nm激發(fā)時，發(fā)射顯著增加(圖2d),，這表明外延惰性殼與耦合到表面的Tm3+激活劑分離,。在1680 nm處發(fā)射的熒光壽命由0.2 ms和0.8 ms變化為5.2 ms，表明LiYF4殼體增厚降低了表面淬滅,，在2.8 ~ 5.0 nm范圍內(nèi)壽命對殼體厚度特別敏感,。鑒于此，推測這一現(xiàn)象可以從兩個方面解釋:(1)惰性殼抑制了濃度和表面淬滅，以及(2)Tm3+濃度的增加增強了CR過程,。

值得注意的是,，摻雜高濃度的Tm3+使Tm-NPs在NIR-II區(qū)域(1208 nm, 3H5狀態(tài))激發(fā)，(800 nm處吸收截面為8.25 × 10?22 cm2, 1208 nm處吸收截面為1.5 × 10?21 cm2),。這些Tm-NPs在1208 nm的照射下產(chǎn)生的發(fā)射峰和分支比與在800 nm激發(fā)下看到的相同,。隨著Tm3+離子濃度的增加或殼層厚度的變化，分別觀察到DSL發(fā)射增強,，且趨勢相同(圖2e),，說明這些發(fā)射波段來自相同的躍遷過程。這是di一次報道在可分散的NPs中觀察到Tm3+在1600-2100 nm的發(fā)射,，特別是在800 nm和1208 nm激發(fā)時,。

接下來,，選擇了與Tm3+能級匹配的摻雜離子（如Er3+和Dy3+）用于能量捕獲,，旨在提供更明亮的NIR-II發(fā)射。首先在800 nm激發(fā)下研究了Er3+離子摻雜劑,。其中,，當摻雜Er3+時(<1%,，0.2%為蕞佳，Tm(02Er)-NPs),，1680 nm處的下轉(zhuǎn)移發(fā)射得到了提高,，摻雜更多的Er3+導(dǎo)致了下降趨勢(圖2f)。此外,，研究3F4狀態(tài)下相應(yīng)的時間分辨種群(圖2g),。通過Tm3+和Er3+之間的能量轉(zhuǎn)移，抑制Tm3+的CR,，加速了3F4狀態(tài)的減少(圖2 h),。當Er3+摻雜濃度進一步增加到10%以上時，雖然在1600-2100 nm處的發(fā)射強度有所降低,，但在近紅外區(qū)域,，通過四波長照射，甚至可以激發(fā)得到Tm/Er“合金"NPs(如30%Er摻雜,，Tm(30Er)-NPs),，并分別在980 nm和1530 nm激發(fā)時觀察到附加發(fā)射帶(圖2i，吸收截面:800 nm時9.5 × 10?22 cm2, 980 nm時1.075 × 10?21 cm2, 1208 nm時1.75 × 10?21 cm2, 1530 nm時2.12 × 10?21 cm2),。值得注意的是,，由于4I13/2水平的Er3+種群的增加，也發(fā)生了1525 nm輻射(4I13/2→4I15/2),，如在980 nm激發(fā)下,。此外,，在800 nm激發(fā)(4 W/cm2)下,，Tm-NPs的發(fā)光量子產(chǎn)率(1600-2050 nm)為~14.16%,，Tm(02Er) NPs的發(fā)光量子產(chǎn)率為~16.13%。這些“合金"NPs為成像,、防偽等涉及多波長選擇性激發(fā)調(diào)節(jié)的應(yīng)用開辟了新的途徑,。然而，摻雜Dy3+并沒有提高近紅外發(fā)射,，在Tm3+晶格中摻雜少量Dy3+(0.2%)會被強烈淬滅,，因為Dy3+具有密集的階梯狀能級。

圖2

基于Tm的NPs進行表面修飾,，以提高其生物相容性

對于生物成像,，選擇優(yōu)化的Tm(02Er)-NPs，并使用DSPE- PEG2000通過疏水-疏水相互作用進行修飾(圖3a),。聚乙二醇化后得到Tm(02Er)-NPs@PEG, TEM圖像如圖3b所示,，無明顯聚集，動態(tài)光散射測定的水動力直徑為112±0.7 nm(圖3c),。監(jiān)測長期膠體穩(wěn)定性1個月,。如圖3d所示，在這段時間內(nèi)沒有發(fā)生明顯的尺寸變化,，也沒有發(fā)生解離或沉淀,，說明Tm探針在水溶液中分散良好且穩(wěn)定。由于O?H振動的非輻射失活(圖3e),， Tm探針在水溶液中的發(fā)光強度比在環(huán)己烷中下降得更多(9.4倍,，在1680 nm處計算)。然而,，1738 nm處的DSL強度與1680 nm發(fā)射處的DSL強度之比從0.37(環(huán)己烷)增加到0.76(水),，這是因為在該區(qū)域水的吸收比環(huán)己烷低(圖1a)。

值得注意的是,，Tm3+的DSL可以從NIR-IIb到NIR-IIc,。以發(fā)射在NIR-IIb區(qū)域(1525 nm)的基于Er的NPs為參考，量化NIR-IIc發(fā)射的優(yōu)勢,。在800 nm激發(fā)下,，在NIR-IIb和NIR-IIc下，記錄了相同濃度的基于Er-和Tm -NPs的相似發(fā)射強度(圖3e),，隨后使用HgCdTe (MCT)相機在不同的子窗口中成像(圖3f),。兩種探針分別在1524-1536 nm和>1700 nm范圍內(nèi)可以清晰區(qū)分。此外,，盡管兩者都可以在1500-1700nm的子窗口成像,，但隨著長通濾波器從1500,、1600到1700nm的變化，Er-NPs@PEG逐漸變得無法檢測到而明亮的基于Tm的探針仍然存在,。這些結(jié)果表明,，基于Tm的NPs可以作為NIR-IIb/c的優(yōu)秀候選。此外,，在相同強度下,，填充這些納米探針的毛細血管的發(fā)光圖像顯示，當SBR為1.35,FWHM = 0.55 mm的5 mm厚的1%脂內(nèi)溶液覆蓋時,，仍然可以觀察到基于Tm的NPs的發(fā)射,，而Er-NPs@PEG的發(fā)射幾乎無法檢測到，這表明在NIR-IIb/c區(qū)域使用基于Tm的NPs具有相當大的穿透性和清晰度(圖3g, h),。此外,，24小時CCK8檢測顯示，即使?jié)舛雀哌_800µg/mL, Tm納米探針的細胞毒性也很低(>90%存活率),。

圖3

體內(nèi)成像研究

為了評估使用基于Tm的探針成像的可行性,，并在NIR-IIb/c中實現(xiàn)理想的清晰度和深層組織穿透，shou次在800 nm激發(fā)下使用MCT相機檢測超過1700 nm的發(fā)光來驗證小鼠的全身血管成像和血液循環(huán),。強烈的NIR-IIc信號使注射后2分鐘循環(huán)系統(tǒng)清晰可見,。信號隨注射后時間的增加而減小。隨著時間推移,，肝臟清晰可見(圖4a),，表明Tm-探針主要通過肝膽系統(tǒng)代謝。此外,，由同一血管測定的NIR-IIc信號強度在血液中表現(xiàn)出中等的半衰期(49 min),，可以勾畫出病理狀態(tài)下的血管血流動力學(xué)。與超過1500 nm成像(FWHM = 78µm)相比,，通過高斯擬合測量FWHM,，確定NIR-IIc區(qū)域血管寬度為64µm(圖4b)，這表明NIR-IIc成像的空間分辨率提高了,。這些結(jié)果證實了NIR-IIc區(qū)域的高分辨率成像性能,。

此外，使用MCT和InGaAs (SD 640)攝像機進行血管成像,，以確認基于Tm的探針在NIR-IIb區(qū)域的成像輪廓,。結(jié)果表明，兩者的組織SBR相似(~2.2),。而在相同條件下,，除了InGaAs相機采用高增益模式外，MCT相機的背景噪聲較低,。這表明基于Tm的探針是優(yōu)秀的NIR-IIb成像探針,，它也可以在InGaAs相機上成像良好,。同時，Tm探針在1500 - 1600 nm之間具有微弱的發(fā)射,，因此使用1500 nm LP在NIR-IIb窗口的探測主要從1600 nm開始,。此外，用Tm探針處理的小鼠的組織學(xué)評估顯示,，主要器官沒有明顯損傷,。最后，采用Tm探針進行NIR-IIc成像,，建立手術(shù)誘導(dǎo)的大腦中動脈閉塞(MCAO)模型，以可視化血液循環(huán)系統(tǒng)功能障礙,。成像結(jié)果顯示循環(huán)障礙,，并且小鼠機體通過自我保護機制建立了側(cè)支循環(huán)。

此外,，為了證明在1700-2100 nm范圍內(nèi)檢測NIR-IIc成像的優(yōu)勢,，將Tm(02Er)-NPs@PEG和Er-NPs@PEG探針(相同濃度)的混合物靜脈注射到小鼠體內(nèi)，并用MCT相機在800 nm激發(fā)下成像,。如圖4d, e所示,，NIR-IIc成像的SBR(1.56)高于NIR-IIb成像(SBR = 1.27)。并且,，與NIR-IIb相比,，NIR-IIc窗口可以更清晰地觀察到微小的血管(包括Tm3+的部分發(fā)光)，這意味著比基于Er (NIR-IIb)的探針成像深度更深,，清晰度更高,。接著在口服灌胃小鼠兩種發(fā)光強度相同的探針的混合物后，進行胃腸道成像,。灌胃1.5 h后,，評價NIR-II在不同子窗口的成像性能。與Er納米探針的NIR-IIb成像(SBR = 5.4)相比,，Tm基探針在NIR-IIc區(qū)域觀察到更高的SBR(8.6)(圖4f, g),。本文認為在1700-2100 nm子窗口的熒光/發(fā)光成像是一個重大突破，因為在1880 nm附近光吸收增加,，光子散射最小化,，組織自身熒光進一步被抑制。

繼續(xù)使用Tm(30Er)-NPs@PEG探針進行了體外和體內(nèi)成像,，以提供多波長激發(fā)特性的概念證明,。使用1%的脂內(nèi)溶液驗證Tm(30Er)NPs@PEG的NIR-IIc成像特性。在800 nm,、980 nm和1208 nm激發(fā)下,，可以觀察到類似的穿透深度和SBR,。其中，在800 nm激發(fā)下,，侵徹深度最深,。但是，在1530 nm激發(fā)時,，由于水的強烈吸收,，導(dǎo)致滲透深度蕞低(3 mm厚度以內(nèi))。進行胃腸道成像,。在灌胃30 min后記錄NIR-IIc的發(fā)光信號(1750-2250 nm),。SBR結(jié)果(圖4h)顯示，800,980和1208 nm激發(fā)提供了優(yōu)秀的NIR-IIc成像,。但是在1530 nm激發(fā)時,，由于水在1500 nm附近有強烈的吸收峰，無法獲得高質(zhì)量的寬場成像,。

最近有報道稱,，在1540 nm或1650 nm激發(fā)下，NIR-IIc共聚焦顯微鏡可實現(xiàn)穿透深度為~500 μm的腹股溝淋巴結(jié)成像,，其穿透深度是1200-1400 nm范圍內(nèi)的兩倍,。但是，需要更高的功率密度的1540nm的光,。這些結(jié)果表明,，如果通過增加激發(fā)功率或提高探針亮度來克服由于吸水引起的干擾，那么將激發(fā)和發(fā)射擴展到NIR-II可以提高成像性能,。由此可見,，這種多波長激發(fā)和發(fā)射系統(tǒng)(圖4i)為多通道成像/解耦治療提供了蕞佳選擇。

圖4

結(jié)論：本文成功開發(fā)了一種高效的基于Tm3+的NIR-II發(fā)光納米探針,，其發(fā)射波長約為1800 nm,，具有良好的生物相容性和良好的穩(wěn)定性。納米探針在800和1208 nm進行雙波長激發(fā),，表現(xiàn)出NIR-IIb到NIR-IIc發(fā)射(1600-2100 nm,3F4→3H6),。這種qian所未有的光學(xué)特性將為體內(nèi)高對比度深層組織成像提供替代方案。值得注意的是,，本文的研究結(jié)果表明,，Tm探針輔助NIR-IIc成像在穿透深度和清晰度方面明顯優(yōu)于NIR-IIb子窗口，這可能是由于受限的散射背景,。重要的是,，在這項工作中，濾波片和成像探針的發(fā)射特性共同決定了實際的成像窗口,。要詳細地分析窗口的優(yōu)勢,，未來的研究必須盡可能地保證特定窗口內(nèi)的均勻發(fā)射和檢測,。預(yù)計本項工作將促進NIR-IIc區(qū)域所需的、具有更高量子產(chǎn)率的探針的研究和開發(fā),。

參考文獻

Chang, Y.; Chen, H.; Xie, X.; Wan, Y.; Li, Q.; Wu, F.; Yang, R.; Wang, W.; Kong, X., Bright Tm(3+)-based downshifting luminescence nanoprobe operating around 1800 nm for NIR-IIb and c bioimaging. Nat Commun 2023, 14 (1), 1079.

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機,，活體穿透深度高于15mm

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