本文要點：熒光引導手術(shù)需要近紅外熒光團的發(fā)展,。吲哚菁綠(ICG)應用廣泛,，臨床記錄安全,，但其在780 nm處的zui大吸收波長較短,，因此需要利用較長波長的染料來發(fā)揮其低光毒性和深滲透的優(yōu)點。在這里,，作者團隊報道了一種穩(wěn)定的深近紅外(NIR)熒光染色支架ECY,，它在CH2Cl2中吸收/發(fā)射836/871 nm，熒光量子產(chǎn)率為16%,。對ECY進行了更合理的生物分布的特異性設計,。合成了類似的含不同數(shù)目的磺酸基或聚乙二醇鏈。通過對BALB/c小鼠靜脈注射的重點文庫進行篩選,，發(fā)現(xiàn)ECYS2是肝膽排泄器官生物成像的合適候選者,，ECYPEG是血管成像的zui 好的候選者。它們在術(shù)中成像中具有一定潛力,。ECY是一種在836 nm處吸收的明亮熒光團,，量子產(chǎn)率為16%，具有超光穩(wěn)定性。其對肝臟,、膽囊,、膽管或腸道的生物分布特異性已通過分子工程實現(xiàn)。近紅外二區(qū)小動物活體成像系統(tǒng) - MARS

生物成像光譜區(qū)域正向較長波長的方向轉(zhuǎn)變,。對于小動物的體內(nèi)成像或術(shù)中成像,，組織穿透深度是首要考慮的問題。為了避免背景組織被血紅蛋白和含氧血紅蛋白吸收,，要求在650 nm以上的光下進行實驗,。穿透深度進一步受到組織散射的限制，其與波長的四次方成反比,。目前的基準近紅外熒光團是Indocyanine Green (ICG),。它已廣泛應用于臨床背景下的眼底血管造影術(shù)、肝功能評估和熒光引導手術(shù),。體內(nèi)成像需要深入到超過800 nm的長波長區(qū)域,，即深近紅外。對于這種深近紅外光譜區(qū)域,，需要一種多功能,、明亮、生物相容性和生物分布特異性的熒光團,。

近紅外活性物質(zhì)種類繁多，有機熒光團因其較高的臨床轉(zhuǎn)譯潛力尤其受歡迎,。ICG所屬的聚甲基花菁是20世紀30年代首ci報道的最著ming的一類長波長染料,。它們在有機溶劑中表現(xiàn)出較窄的吸收帶和較高的摩爾吸光度。然而,，花菁,，特別是吸收波長超過800 nm的花菁，越來越容易發(fā)生極性/聚集誘導的對稱性破壞,，從而導致其S0-S1吸收帶的峰移,、帶寬和低色移。這些光譜變化即使不阻止高對比度多路復用的潛力,，也會使其復雜化,。

DAD/ADA型熒光染色支架是近紅外染料家族的新成員。它們的吸收帶通常較寬(FWHM > 100 nm),，摩爾吸光度較低,。2017年，我們報道了一類新的近紅外熒光團,，即EC5,，其第yi個體現(xiàn)是在CH2Cl2中吸收880 nm的明亮深近紅外熒光團(ECX)。它的吸收強度高，吸收銳利,，其吸收/發(fā)射zui大值受溶劑化變色的影響最小,。多年來，808 nm激光線在近紅外生物成像中越來越受歡迎,，而ECX在808 nm的吸收是最小的(圖1),。

為了解決這個問題，作者團隊計劃開發(fā)一種易于被808 nm激發(fā)的EC5衍生物,。由于顯像劑的結(jié)構(gòu)/生化特異性是外科醫(yī)生最關(guān)心的問題,，因此需要對其生物分布進行系統(tǒng)研究。生物相容性是體內(nèi)成像的另一個至關(guān)重要的參數(shù),。理想情況下,，它需要是水溶性的，易于代謝/排泄,，毒性最小,。

圖1（ICG和ECX的吸收光譜顯示它們在830 nm處不明顯吸收，以及ECY的通用結(jié)構(gòu)）

在這項工作中,，作者團隊設計并合成了一種在CH2Cl2中吸收836nm的明亮熒光團ECY,。為了得到ECY的水溶性類似物，作者團隊進一步安裝了不同數(shù)量的磺酸基,，即不含ECYa,，含1個ECYS1，含2個ECYS2,，含3個ECYS3,，或平均分子量為5000 amu的聚乙二醇鏈，即ECYPEG,。評價了它們的光物理性質(zhì)和激發(fā)態(tài)動力學,、穩(wěn)定性、急性毒性,、代謝和生物分布,。最后，作者團隊研究了它們在體內(nèi)生物成像中的可行性,。

隨著n-取代基給電子能力的降低,，羅丹明染料的波長會發(fā)生藍移。因此,，作者團隊將ECX的juloliine取代基改為二乙胺,，從而得到了具有藍移波長的染料ECY。ECY的合成方法與ECX類似(方案1),。

方案1：ECYa-d及其水溶性類似物（ECYS1,，ECYS2，ECYS3，ECYPEG）的合成過程,。

在不同溶劑中檢測了它們的光譜特性(圖2和表1),。ECYa在CH2Cl2中的吸收光譜是典型的聚甲基花菁，在836 nm處有一個主波段,，在752 nm處有一個肩帶(圖a),。它在380 - 780 nm的整個可見范圍內(nèi)的吸收很弱，在556 nm,、516 nm和470 nm處有三個峰指,。激發(fā)后，ECYa在871 nm處發(fā)射zui大(Φ?16%),，在914 nm處有尾峰,。ECYa的光譜性質(zhì)表現(xiàn)為溶劑致變色，但程度不顯著,。其吸收zui大值在甲苯中藍移822 nm,，在CH3CN中藍移829 nm，在DMSO中紅移852 nm,，在中性磷酸鹽緩沖液(PBS, 10 mmol/L, pH 7.4,，含10% DMSO)中紅移846 nm。ECYS1的水溶性實際上比ECYa差,，而ECYS2和ECYS3具有較高的水溶性(> 10 mg/mL),。之后獲得了ECYS1在CH2Cl2、ECYS2和ECYS3在HEPES緩沖溶液(10 mmol/L, pH 7.4, 0.1% DMSO)中的光譜(表1),。

圖2.紫外-可見吸收,，（A）ECYa，（B）ECYS1,，（C）ECYS2，（D）ECYS3,，（E）ECYPEG的熒光發(fā)射光譜,。它們的化學結(jié)構(gòu)以插圖形式包括在內(nèi)。這些吸收和發(fā)射光譜被進一步去卷積,，組成帶被繪制在相應的光譜下方,。ECYa和ECYS1溶解在CH2Cl2，ECYS2,，ECYS3和ECYPEG溶解在HEPES緩沖液中,。（F）ECYa在CH2Cl2和水介質(zhì)中的吸收光譜比較。

表1

總的來說,，它們的吸收光譜保持了菁的特征,，與ECYa的吸收光譜基本相似。觀察到約10 nm的輕微峰移和約160 cm2 /15 nm的帶寬。溶劑致變色的不顯著性歸因于這樣一個事實,，即磺酸基安裝在二苯醚或底部苯基上,，它們在電子上與熒光致變色核心正交。

ECYPEG在HEPES中具有高水溶性,，在851 nm處吸收,，在890 nm處釋放。根據(jù)之前報道的方法,，將CH2Cl2中ECYa的光譜擬合到由8個構(gòu)成高斯峰的數(shù)學模型中,，即a1, a2, a3, a4, a5, a6, a7和a8的zui大波長遞減。在較長光譜區(qū)域(700-900 nm)的峰a1, a2, a3和a4可能是從zui低振動水平S0到較高振動水平S1的HOMO-LUMO躍遷,。在350-700 nm波長較短的區(qū)域,，從較低的已占軌道到LUMO軌道的躍遷，共識別出a5,、a6,、a7和a8四個波段?；ㄝ既玖媳憩F(xiàn)出一個尖銳而強烈的主帶和一個不那么尖銳和低強度的肩帶,。以ECYa為例，這兩個峰分別為a1和a3,，F(xiàn)WHM′分別為689 cm-1和1022 cm-1,。作者認為，四個波段(a1:a2:a3:a4)的振子強度(f)對整個光譜的貢獻百分比可以作為評價染料的一個可行的定量指標,。

ECYa的花菁度為63:4:14:2,。當溶解在HEPES (10 mmol/L, pH 7.4，添加0.5% ten -80)中,，ECYa的花菁光譜特征保持不變,，但峰a1和a3都略有變寬，F(xiàn)WHM分別為854 cm-1和1247 cm-1(圖F),。在58:5:21:4時,，四個波段的貢獻百分比基本相同。ECYS1在CH2Cl2,、ECYS2,、ECYS3和ECYPEG在HEPES中的吸收光譜(圖2)B-E)同樣是反卷積的。a1波段寬度分別為701 cm- 1,850 cm- 1,845 cm-1和858 cm-1,，貢獻率分別為62%,、54%、55%和58%,。

用自制的帶有近紅外CCD相機的外顯熒光顯微鏡對這些ECY染料的光穩(wěn)定性進行了評估,。將ECYS2/ECYS3/ECYPEG/ICG溶液分別置于含10%血清的PBS中,，滴在玻片上，用蓋玻片密封,。在808 nm激光激發(fā)下,，用長通濾波器在850 nm處獲得ICG/ECYS2/ECYS3/ECYPEG的熒光強度。ICG的熒光強度在幾秒鐘內(nèi)下降了約79.6%,，而ECYPEG沒有表現(xiàn)出明顯的漂白,。無論它們的頭基和取代基如何，都表現(xiàn)出良好的光穩(wěn)定性,。由于ECYS1的水溶性較差,，因此未測試其光穩(wěn)定性。

圖3.ECYS2,、ECYS3,、ECYPEG 和 ICG 在含有10%血清的PBS中的光穩(wěn)定性研究，通過連續(xù)808nm激光照射密封在載玻片和蓋玻片之間的溶液進行,。

作者團隊篩選了用于生物分布的不同取代的ECY染料的聚焦庫,，即ECYa，ECYS2,，ECYS3,，劑量為1mg / kg和ECYPEG，劑量為3mg / kg,。ICG常規(guī)用于手術(shù)中的脈管系統(tǒng)成像,，并用作參考。然而,，其快速的肝膽清除是一個實際的限制,。在作者的實驗中，ICG（1mg / kg）通過尾靜脈注射到BALB / c小鼠中,。用808nm的激光照射小鼠,，并通過截止波長為1200nm的長波通濾光片收集熒光發(fā)射。在短短2分鐘內(nèi),，肝臟的信號強度已經(jīng)比頦下靜脈高1.7倍,，比右大隱脈管系統(tǒng)高3.5倍。在1小時內(nèi),，脈管系統(tǒng)中ICG的發(fā)射不再明顯。在接下來的幾個小時里,，小強度和盲腸依次亮起,，突出了其肝膽清除途徑和通過糞便排泄。通過監(jiān)測肝臟和后肢脈管系統(tǒng)中ICG的熒光強度,，計算出血液循環(huán)和肝膽清除率的半衰期分別為6.4±0.2分鐘和144.3±14.9分鐘,。尾靜脈注射ECYa,，ECYS3和ECYPEG時也清楚地觀察到小鼠脈管系統(tǒng)，但ECYS2除外,，因為它的肝臟攝取快,。與ICG相比，ECYa（1mg / kg）表現(xiàn)出改善的血液潴留,，這在前兩小時內(nèi)拍攝的圖像中很明顯（圖4A）,。來自脾臟的信號強度變強，包括胸骨和脛骨在內(nèi)的骨骼也被點亮,，可能是由于免疫原性相互作用,。在12小時內(nèi)，在肝臟,，腸道和脊柱中仍然可以看到排放,。其血液保留半衰期為35.6±7.7分鐘。發(fā)現(xiàn)排泄主要通過網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng),，排泄半衰期為789.8±93.5分鐘,，是整個系列研究中最慢的。ECYS2（1mg / kg）的生物學分布和藥代動力學與ICG相似,，即肝臟快速攝取,，血液保留半衰期短，為2.4±0.7分鐘,，排泄快,。

一個有趣的發(fā)現(xiàn)是，在注射后2-4小時內(nèi),，膽囊與周圍組織形成高對比度染色,。因此，它還顯示出在肝移植期間進行術(shù)中膽管造影以避免膽管醫(yī)源性損傷的潛力,。與其他幾種染料相比,，ECYS3（1 mg / kg）在qian10分鐘內(nèi)產(chǎn)生最亮的脈管系統(tǒng)信號強度。然而,，由于兩個原因,，它不是一個好的候選人。首先,，它的生物清除速度很快,，甚至比ICG還要快。其次,，它表現(xiàn)出意想不到的皮膚親和力,，這解釋了更明亮的信號強度。來自皮膚的強烈信號實際上使深部組織脈管系統(tǒng)的觀察變得困難,。ECYS3的血液循環(huán)時間為18.6±1.4 min,，肝臟吸收后排泄更快,，排泄半衰期為60.5±10.9分鐘。ECYPEG（3 mg/kg）表現(xiàn)出強大的脈管成像能力,。在前2分鐘內(nèi),，ECYPEG點亮了精神下，腹部和后肢脈管系統(tǒng)等,，肝臟攝取程度相對較低,，其中平均信號僅比1.9倍強右隱脈管系統(tǒng)的比率分別為3.5、3.3,、7.4和1.9,。在接下來的3 h中，盡管腦和后肢脈管系統(tǒng)中的信號強度逐漸降低,，但突出顯示的血管的信噪比（SBR）保持在zui大值的一半以上,，而注射ICG后幾乎沒有熒光信號可見。計算血液保留半衰期為147.5±34.8分鐘,，排泄半衰期為244.1±19.7分鐘,。

圖 4.（A）在不同時間點用808nm激光線（1200nm長通濾光片，50ms）靜脈注射ICG,，ECYa,，ECYS2，ECYS3和ECYPEG后仰臥位小鼠的NIR熒光成像,。（B,C）ICG,，ECYa，ECYS2,，ECYS3和ECYPEG給藥小鼠肝臟和右隱脈管系統(tǒng)的代表性熒光強度作為時間的函數(shù),。（D）清醒小鼠的呼吸頻率（每分鐘170次呼吸），通過檢測靜脈注射ECYPEG（1100nm長通濾光片,，5ms）后肝臟運動的熒光信號波動進行分析,。所有圖像均使用808 nm激光線（150 mW/cm）獲得。

通過比較肝臟中的熒光強度,，親脂性ECYa的代謝和排泄最慢,，ECYPEG的代謝和排泄速度第二慢（圖4B）。所有磺酸鹽衍生化類似物的代謝速度都快于ICG,。為了比較它們的血液保留,，外推后肢脈管系統(tǒng)的熒光強度（圖4C）。ECYPEG是最持久的,。其信號在注射后的前30分鐘內(nèi)逐漸增加,，然后在ca內(nèi)保持穩(wěn)定。隨后緩慢下降前30分鐘,。ECYPEG用于通過視頻速率成像監(jiān)測小鼠呼吸（圖4D）,。計算呼吸頻率為170次呼吸/分鐘。研究了ECY染料的細胞活力,，并且所有染料的細胞毒性都可以忽略不計,。zui有希望的候選者（ECYPEG）和次佳候選者（ECYa）被送去用小鼠進行急性毒性研究。發(fā)現(xiàn)ECYPEG在高達200mg / kg的zui高測試劑量下沒有表現(xiàn)出急性毒性,，而LD50ECYa的14.7±1.8毫克/千克,。ECYPEG的生物相容性進一步證明了良好的肝功能和器官組織學。根據(jù)血液保留半衰期,、肝膽清除半衰期和生物相容性,，選擇ECYPEG進行進一步研究。

作者團隊進一步優(yōu)化了ECYPEG更高SBR的成像參數(shù),，同時展示了肢體和大腦中更細血管的概念驗證脈管系統(tǒng)成像,。將ECYPEG靜脈注射到小鼠尾部，在808 nm激光線激發(fā)下,，用不同截止波長的長波通發(fā)射濾光片收集熒光信號,。使用1000 nm的長波通和1100 nm（1 ms），（5 ms）,，1200 nm（20 ms）,，1300 nm（50 ms），1400 nm（300 ms）,，1500 nm（600 ms）的曝光時間獲取了一系列圖像（圖5A）,。一個普遍的趨勢是，更長的截止波長導致較少的組織散射程度,，改善SBR（圖5D）和空間分辨率,，但以犧牲曝光時間為代價。在后肢脈管系統(tǒng)的成像過程中也發(fā)現(xiàn)了相同的趨勢（圖5 B-E）,，其中可以明顯觀察到FWHM為71.1μm的血管（圖H）,。曝光時間和SBR之間的折衷導致確定為1300 nm / 50 ms用于未來的成像研究。

圖5.通過尾靜脈注射ECYPEG對BALB / C小鼠進行體內(nèi)成像,。（A）全身成像,，依次用1000、1100,、1200,、1300、1400,、1500nm的長波通發(fā)射濾光片進行,。比例尺：1厘米。（B）用1150,、1250,、1350和1450nm的長波通濾光片對后肢血管進行熒光成像,。比例尺：2毫米。（C）使用1350 nm長波通濾光片進行腦脈管系統(tǒng)成像,。比例尺：分別為 2 毫米,、1 毫米、0.5 毫米,。（D）圖中突出顯示的腹部（綠線）和后肢（紅線）血管的信噪比（SBR）,。5A.（E）圖5B中突出顯示的血管的SBR （F，G） 圖5C1-C2中脈管系統(tǒng)沿藍線的相應SBR,。（H）橫截面熒光強度分布（黑點）和高斯在圖 5C3 中適合其直徑的紅線,。所有圖像均使用808 nm激光線（120 mW/cm2）

討論：作者團隊進一步使用 ECYPEG 從上視圖對大腦脈管統(tǒng)的微小血管通過完整的顱骨進行成像，激發(fā)波長為 808 nm,，長通截止波長為 1350 nm,，曝光時間為 100 ms，放大倍率為 0.64,。靜脈注射ECYPEG（3mg/kg）后,，可以清楚地區(qū)分與SSS相連的腦下靜脈（ICV）、橫竇（TS）,、上矢狀竇（SSS）和淺靜脈（SV）,。較短的曝光有利于高成像幀速率，而較長的曝光時間可改善SBR,。例如,，為了實現(xiàn)更豐富的脈管系統(tǒng)網(wǎng)絡觀察，曝光時間設置為500毫秒,。在100 ms的曝光下,，通過兩個毛細管的線輪廓（以藍色突出顯示，圖5C）,，計算出SBR為1.11和1.16（圖5F）,。通過增加到500 ms，獲得1.22和1.26的SBR（圖5G）,。3倍的更高放大倍率和500毫秒的曝光時間提供了更高的空間分辨率,。用良好的SBR觀察到表觀寬度僅為6.3μm的微血管（圖5）。

綜上所述,，作者團隊在CH2Cl2中開發(fā)了一種明亮的深近紅外熒光團(ECY),，吸收/發(fā)射波長為836 nm, FWHM窄至689 cm-1。通過引入不同數(shù)量的磺酸鹽(ECYS1,、ECYS2和ECYS3)或聚乙二醇鏈(ECYPEG),，作者團隊進一步合成了一個ECY水溶性的集中庫。在活體小鼠成像中進行了測試。ECYS2具有肝膽代謝器官成像的潛力,，ECYPEG具有血管成像的潛力,。這項工作為未來發(fā)展用于深近紅外多路復用的熒光團提供了一個框架。此外,，該工作的熒光團在基礎研究,、轉(zhuǎn)化醫(yī)學和外科手術(shù)中具有廣泛的實際應用潛力。

參考文獻

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