本文要點(diǎn)：光聲成像(PAI)/第二近紅外窗口熒光成像(NIR-II FI)雙模式成像技術(shù)由于具有較高的空間分辨率和信噪比,，在檢測(cè)腫瘤組織和前哨淋巴結(jié)(SLN)方面具有廣闊的應(yīng)用前景,。本研究以苯并噻二唑?yàn)殡娮邮荏w，開(kāi)發(fā)了兩種聚集誘導(dǎo)發(fā)光劑(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD),，首ci將PAI/NIR-Ⅱ FI應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)及其SLNs的診斷和治療,。其中，C-NTBD納米粒子具有較好的PAI和NIR-II熒光性能,，其zui大吸收波長(zhǎng)位于732 nm,，發(fā)射峰位于1042 nm。在荷NENs裸鼠模型中,，在PAI術(shù)前成功定位NENs后,，再用NIR-II FI檢測(cè)SLN。在C-NTBD納米粒子的NIR-II FI引導(dǎo)下,，發(fā)現(xiàn)并精確地切除了位于胸壁的遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的直徑為1 mm的SLN,。

背景：神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)是一組起源于肽能神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移?，F(xiàn)代影像技術(shù)仍然無(wú)法準(zhǔn)確識(shí)別微小的NENs病變組織和SLNs(毫米級(jí)),。為了克服單一成像模式的不足，多模式成像技術(shù)被開(kāi)發(fā)出來(lái),，以綜合兩種或兩種以上成像模式的優(yōu)點(diǎn),。由于PAI的高空間分辨率和NIR-II FI的高信噪比的優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，PAI/NIR-II FI雙模態(tài)成像技術(shù)在腫瘤組織和SLNs的檢測(cè)中顯示出巨大的應(yīng)用前景,。術(shù)前PAI成功定位腫瘤組織后,，術(shù)中NIR-II FL可準(zhǔn)確檢測(cè)SLNs，預(yù)防性剝離SLNs,，降低腫瘤殘留率,。然而,，在以往的研究中，PAI/NIR-II FI主要應(yīng)用于腫瘤的診斷,，而其在腫瘤和SLN診斷中的應(yīng)用研究較少,。

研究?jī)?nèi)容：本研究以苯并噻二唑?yàn)殡娮邮荏w，開(kāi)發(fā)了兩種聚集誘導(dǎo)發(fā)光劑(AIEgens)(C-NTBD和O-NTBD),，首ci將PAI/NIR-Ⅱ FI應(yīng)用于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤(NENs)及其SLNs的診斷和治療,。其中，C-NTBD納米粒子具有較好的PAI和NIR-II熒光性能,，其zui大吸收波長(zhǎng)位于732 nm,，發(fā)射峰位于1042 nm，血管造影分辨率高達(dá)20μm,。在C-NTBD納米粒子的實(shí)時(shí)NIR-II FL引導(dǎo)下,，發(fā)現(xiàn)并精確地切除了位于胸壁的遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的直徑為1 mm的SLN。這種雙模態(tài)成像技術(shù)可以提高術(shù)中切除SLNs的準(zhǔn)確性,，改善患者的預(yù)后,，為準(zhǔn)確治療NENs提供新的策略。(Scheme 1)

首先,，作者進(jìn)行了分子設(shè)計(jì)和合成,，然后進(jìn)行了理論計(jì)算。為了探索更多的C-NTBD和O-NTBD的結(jié)構(gòu)信息,，用Gaussian 09 W程序,，用B3LYP/6-31G*基組模擬了它們的分子優(yōu)化結(jié)構(gòu)和分子軌道能級(jí)信息。C-NTBD和O-NTBD都表現(xiàn)出扭曲的立體結(jié)構(gòu),，這可以有效地防止聚集態(tài)的堆積(例如,，π-π堆積)。C-NTBD和O-NTBD在π電子傳遞單元和電子受體苯并噻二唑之間的二面角分別為48.1?和38.7?(圖1B),。C-NTBD的分子結(jié)構(gòu)比O-NTBD更扭曲,，這更有利于分子激發(fā)態(tài)能量通過(guò)輻射途徑耗散。如圖1C所示,，C-NTBD和O-NTBD的zui低未占分子軌道(LUMO)電子密度都主要集中在苯并噻二唑部分,，而它們的zui高占據(jù)分子軌道(HOMO)的軌道能級(jí)沿分子骨架均勻分布。

Figure 1

然后作者研究了C-NTBD和O-NTBD的光物理性質(zhì),。C-NTBD的吸收峰和摩爾消光系數(shù)(ε)如圖2a所示,。O-NTBD與C-NTBD相比吸收峰紅移，因?yàn)橥檠趸纫一哂懈鼜?qiáng)的供電子能力,，這一結(jié)果與激發(fā)態(tài)計(jì)算相一致,。作者還研究了聚集態(tài)分子的吸收性能。將9倍體積的水加入到DMSO溶液中(水的分?jǐn)?shù)為90%)，制備了分子聚集體,。如圖2B所示,，C-NTBD在聚集體中的吸收峰移動(dòng)到了746 nm，O-NTBD在聚集體中的吸收峰也發(fā)生了移動(dòng)(795 nm),。C-NTBD在808 nm處的ε比O-NTBD在溶液和聚集態(tài)下的高,，這有利于C-NTBD更多地吸收光能，轉(zhuǎn)化為近紅外-II熒光和熱,。作者使用靈敏度更高的近紅外成像系統(tǒng)(1000nm LP濾光片)來(lái)測(cè)定C-NTBD和O-NTBD的ΦPL,。如圖2C所示，O-NTBD的ΦPL為0.83%,，而C-NTBD的ΦPL為0.22%,。作者還測(cè)量了它們?cè)诓煌壤腄MSO/甲苯體系中的光致發(fā)光強(qiáng)度。這兩個(gè)分子都顯示出典型的AIE特征,，因?yàn)闊晒鈴?qiáng)度隨著甲苯組份(Ftol)的增加而增加(圖2D),。

Figure 2

接下來(lái)，作者對(duì)C-NTBD和O-NTBD進(jìn)行PEG化修飾(圖3A)得到C-NTBD NPs和O-NTBD NPs,，并對(duì)其進(jìn)行表征,。動(dòng)態(tài)光散射(DLS)結(jié)果表明,，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs平均流體動(dòng)力學(xué)直徑分別為142.49 nm和129.34 nm(圖3B),。TEM結(jié)果表明，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs具有均勻的球形結(jié)構(gòu),，平均直徑分別為139 nm和111 nm(圖3B),。與C-NTBD NPs相比，O-NTBD NPs的zui大吸收波長(zhǎng)(776 nm比732 nm)和發(fā)射峰(1110 nm比1042 nm)顯著紅移(圖3C),。在808 nm激光激發(fā)和1000 nm LP濾光片上,，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs都顯示出顯著的熒光信號(hào)，其中C-NTBD NPs發(fā)射出更強(qiáng)的熒光信號(hào)(圖3D),。C-NTBD NPs在9 mm雞胸肉覆蓋下顯示出明顯的NIR-II熒光信號(hào),，而O-NTBD NPs在6 mm雞胸組織覆蓋度下的熒光信號(hào)非常微弱(圖3D)。這些結(jié)果表明,，與O-NTBD NPs相比,，C-NTBD NPs的NIR-II成像能力更好。

Figure 3

隨后,，作者用熱成像儀研究了C-NTBD納米顆粒和O-NTBD納米顆粒在不同濃度下隨808 nm激光照射時(shí)間的溫度變化,，進(jìn)一步評(píng)價(jià)了它們的光熱轉(zhuǎn)化性能(圖4a和圖4b)。在808 nm激光(0.5W/cm2)照射下,，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的溫度都迅速上升,，并在激光照射5分鐘后達(dá)到穩(wěn)定水平(圖4a&b)。C-NTBD納米粒子和O-NTBD納米粒子表現(xiàn)出濃度依賴(lài)的光熱效應(yīng)。C-NTBD納米顆粒表現(xiàn)出比O-NTBD納米顆粒更好的光熱性能(5min的ΔTmax分別為49.8?C和43.6?C)(圖4C),。此外,，C-NTBD納米顆粒和O-NTBD納米顆粒的光熱性能在5次加熱-冷卻循環(huán)后保持不變，證實(shí)了它們良好的光熱穩(wěn)定性(圖4D),。

Figure 4

作者進(jìn)一步研究了它們的PA性質(zhì),。C-NTBD NPs和O-NTBD NPs分別在755 nm和785 nm的激光波長(zhǎng)下獲得了zui大的PA強(qiáng)度。在760 nm激光照射下,，C-NTBD NPs和O-NTBD NPs的PA信號(hào)都隨著AIEgens濃度的增加而增強(qiáng),，并在3.125-100μM的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系(圖5a和b)。C-NTBD納米粒子在體外表現(xiàn)出比O-NTBD納米粒子更好的PAI性能,，這與其光熱性能是一致的,。如圖5C所示，在給藥C-NTBD NPs(0 h)之前,，腫瘤部位有微弱的PA信號(hào),。靜脈注射C-NTBD NPs后8h達(dá)到zui大值，提示注射后8h是STC NENs進(jìn)行PAI的zui 嘉時(shí)間點(diǎn)(圖5C和圖5D),。這些結(jié)果證實(shí)C-NTBD NPs可作為NENs的有效的高對(duì)比度PAI探針,。

Figure 5

作者還通過(guò)靜脈注射在BALB/c裸鼠大腦皮層血管中進(jìn)一步評(píng)估了C-NTBD NPs用于NIR-II FI的體內(nèi)性能。如圖6A所示,，靜脈注射C-NTBD NPs 5分鐘后,，大腦皮質(zhì)血管顯示明亮的近紅外-II熒光信號(hào)(由1000 nm LP濾光片采集)，成像深度為300μm,，清楚地顯示了大腦皮質(zhì)豐富的血管網(wǎng)絡(luò),。為了進(jìn)一步評(píng)估血管成像的分辨率，選擇其中一個(gè)大腦皮層區(qū)域進(jìn)行放大研究(圖6B),。大腦皮質(zhì)微血管的熒光信號(hào)仍然清晰明亮,，分辨率高(20μm)(圖6D)。這些結(jié)果證明了C-NTBD納米粒在體內(nèi)具有顯著的NIR-II熒光能力,。

Figure 6

最后作者在體內(nèi)NIR-II FI引導(dǎo)下對(duì)荷瘤裸鼠模型進(jìn)行了SLNs手術(shù),。瘤內(nèi)注射C-NTBD NPs后，用NIR-II實(shí)時(shí)成像系統(tǒng)(808 nm激光激發(fā),，1000 nm LP濾光片)對(duì)荷瘤裸鼠全身進(jìn)行成像,。注射后1分鐘，除腫瘤部位可見(jiàn)明亮信號(hào)外,，SLN的信號(hào)以及兩者之間的淋巴引流信號(hào)也隱約可見(jiàn)(圖7B),。值得注意的是，其中一個(gè)SLN位于胸壁,，遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位,，在常規(guī)SLN解剖中極易被忽視,。15分鐘后(圖7C)，鄰近SLN,、遠(yuǎn)端胸壁SLN的信號(hào)及兩者之間的淋巴引流信號(hào)更加明顯,，在注射后1h內(nèi)，信號(hào)強(qiáng)度隨時(shí)間增加(圖7D),。然后,，作者在已建立的NENs模型中實(shí)施NIR-II FI引導(dǎo)下的SLNs手術(shù)。首先切除SLNs區(qū)域的表皮,，然后再次進(jìn)行NIR-II FI,。與去除表皮前相比，SLNs信號(hào)亮度增加(圖7e和f),，表明外科手術(shù)位置是準(zhǔn)確的,。隨后，在NIR - II熒光信號(hào)的引導(dǎo)下,，SLN被精確地移除(圖7g ),。手術(shù)時(shí)間約為10分鐘，分離淋巴結(jié)的大小約為1mm(圖7h和i),。切除腫瘤和SLN后進(jìn)行H&E和免疫組織化學(xué)(IHC)染色,，以確認(rèn)切除的腫瘤是NENs及其SLN(圖7j-o )。

Figure 7

總結(jié)：作者設(shè)計(jì)和合成了兩種以苯并噻二唑?yàn)殡娮邮荏w的NIR-II類(lèi)發(fā)光試劑(C-NTBD和O-NTBD),。為了使疏水的C-NTBD和O-NTBD具有良好的水分散性,，采用納米沉淀法制備了C-NTBD NPs和O-NTBD NPs 。體外研究表明,，與O-NTBD NPs相比,，C-NTBD NPs具有更好的光熱,、PAI和NIR-II FI性能,。以C-NTBD NPs為造影劑，首ci將PAI/NIR-II FI應(yīng)用于神jing,，病變組織和SLN的識(shí)別和治療,。在C-NTBD納米粒子的實(shí)時(shí)NIR-II FL引導(dǎo)下，甚至發(fā)現(xiàn)并精確地切除了位于胸壁的遠(yuǎn)離原發(fā)腫瘤部位的1 mm SLN,。這項(xiàng)工作為NENs的臨床治療提供了一種很有前景的方法,。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1016/j.biomaterials.2022.121780

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