本文要點：無chuang成像技術可以用于可視化骨生長,、異常和代謝,，同時在骨的圖像引導干預和外科手術中發(fā)揮著重要作用。然而,，目前還沒有骨特異性NIR-II成像探針,，能夠實時無chuang檢測骨生長和組織微鈣化。本研究基于結構固有靶向(SIT)策略,，設計靶向近紅外熒光團用于骨組織的無chuang成像,，其中靶向基團或藥效團被納入熒光團的化學結構中。我們對先前開發(fā)的近紅外熒光團進行了改進,，以生成一種腎臟可清除的骨靶向造影劑,。該造影劑具有改進的光學性能和生物分布,，此外還能產(chǎn)生光熱效應(圖1a)。通過在介碳中引入硫原子,，zui終熒光團的峰值發(fā)射波長轉移到NIR-II范圍內,，對光照射的敏感性提高。

背景: 由于NIR-II熒光成像可穿透組織深處并減少散射,，因此在檢測骨生長,、代謝、轉移及其他骨相關疾病方面,，NIR-II熒光成像優(yōu)于常規(guī)可見和NIR-I熒光成像,。而P800SO3-PEG對骨組織具有高親和力，更深的組織成像能力,，其在主要器官中zui小的非特異性攝取以及對激光照射的光熱效應,，使其成為骨靶向治療診斷成像的zui嘉選擇。

方法: 首先,，作者為了研究其穩(wěn)定性與濃度的關系,，將P800SO3-PEG溶于DI水中，在5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水中制備不同濃度10~250μM的工作溶液,。為了獲得光穩(wěn)定性,，使用808nm激光二極管以35mW/cm2連續(xù)照射200μL的工作溶液,，每30分鐘成像一次,，持續(xù)120分鐘。通過測量感興趣區(qū)域(ROI)并將熒光強度與起始熒光信號進行比較來確定其穩(wěn)定性,。之后作者為了測定其光熱效應,，在10mM DMSO染料原液中在1XPBS溶液中制備30μM的ICG、P800SO3和P800SO3PEG,。以PBS作為對照,。將500μL的工作溶液和空白PBS置于1mL試管中，用808nm激光二極管以1W/cm2的速度照射2分鐘,，用熱成像相機成像,。每15秒記錄每個熒光團的熱讀數(shù)。

作者隨后做了鈣鹽實驗,，將碳酸鈣,、草酸鈣、羥基磷灰石,、磷酸鈣,、焦磷酸鈣鹽(25 mg/mL)分別用5μM工作溶液置于1mL的生理鹽水中孵育。將鈣鹽與熒光團在室溫下連續(xù)旋轉30分鐘,。然后用生理鹽水洗滌混合物3次,，然后以3000轉/分離心10分鐘,，以除去未反應的熒光探針。為了比較其結合親和力,，作者將離心后收集的沉淀分散在200μL的生理鹽水中,，熒光成像系統(tǒng)測定分散樣品的熒光強度。所有近紅外熒光圖像在相同的曝光時間下采集,，并以相同的歸一化顯示,。

實驗動物選擇了CD-1小鼠(6-8周，雄性)和無體型NCr nu/nu小鼠(6周),。作者為了研究每個近紅外熒光團的生物分布和清除率,，從10mM DMSO原液中提取0.25-1.0mM的含5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水配制工作溶液，每個近紅外熒光團100μL(25-100 nmol)經(jīng)眶后竇靜脈注射,，術中近紅外熒光成像后處死動物,，切除主要臟器，包括心,、肺,、肝、胰,、脾,、腎、十二指腸,、腸,、肌肉等，并成像觀察組織特異性生物分布,。每個器官/肌肉上方感興趣區(qū)域(ROI)的熒光強度使用ImageJ版本1.52 2p進行量化,。信背比記為SBR。

作者為了測定近紅外熒光團的組織分布,，在CD-1小鼠注射了50 nmol的P800SO3PEG,，在100μL的5%wt/vBSA/生理鹽水后的第1天和第14天摘除骨組織。將解剖的組織裁剪并埋入組織-Tek zui嘉切割溫度(OCT)化合物中,，不進行預固定步驟,，組織塊在-80℃冷凍。用低溫制冷機切割Tµm厚的冷凍切片,。玻片*行熒光分析,，然后進行蘇木精和伊紅(H&E)染色。調整曝光時間以獲得每個熒光圖像相似的zui大熒光值,。作者還從匹配的視場中獲得了h&e染色玻片的亮場圖像,。

結果: 骨靶向近紅外熒光團的理化性質：如圖1b所示，在P800SO3周圍設計P800SO3-PEG，用血清穩(wěn)定但靈活的硫醇PEG連接劑取代根草酸連接劑,，導致zui大吸收光譜和發(fā)射光譜的光束漂移,，從而實現(xiàn)NIR-II尾跡成像。骨靶向近紅外熒光團的理化性質見表1,，分布系數(shù)對數(shù)D是血液中zui終化合物的親脂性和血清蛋白結合的重要預測因子,，P800SO3-Cl是親水性的，但通過在骨架上添加SH或PEG增加了親水性,，這分別將對數(shù)D降低到-7.04和-8.65,。而拓撲極表面積（TPSA）是組織吸收和滲透的指標。而表2總結了在10%胎牛血清(FBS)中測定的骨靶向近紅外熒光團的光學性質,，P800SO3-Cl在817 nm處熒光zui強,，消光系數(shù)高。在同一七甲基氨酸主鏈的中碳上,，氧取代導致熒光發(fā)射的低色移,，而硫原子取代產(chǎn)生42-45 nm的淺色移，從而實現(xiàn)了NIR-II尾成像(圖1e,f),。

圖1

表1

骨靶向近紅外熒光團的血漿蛋白結合,，光穩(wěn)定性和光熱效應：首先是骨靶向近紅外熒光團的血清穩(wěn)定性，作者使用快速平衡透析(RED)裝置測量了它們的血漿蛋白結合(PPB)(圖1g),。在濃度為10µM的5%含牛血清白蛋白(BSA)生理鹽水中制備近紅外熒光團,，在37°C溫和振蕩孵育8h。利用ICG作為對照,。P800SO3-Cl和P800SO3-PEG顯示約40%的PPB,，而P800SO3和P800SO3-SH顯著結合血漿蛋白(>70%)。作者為了測量了這些近紅外熒光團在不同濃度(10-100μM)下的光穩(wěn)定性,，在自制的NIR-II成像系統(tǒng)下,，使用功率密度為35mW/cm2的808nm激光照射2h,，P800SO3和P800SO3Cl在>50µM時表現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性,。然后，作者在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中固定每個熒光團的濃度為30μM,，并在808 nm激光下照射樣品2分鐘,，以證明其假設，這些近紅外熒光團顯示光熱效應如圖1h所示,?？偟膩碚f，在激光照射下,，所有測試的近紅外熒光團都觀察到升高的溫度變化(10-15°C),。其中，P800SO3-PEG和P800SO3-SH表現(xiàn)出zui快的光熱效應,，這與圖S3a中它們的光敏性結果一致,。與P800SO3相比,，P800SO3- peg的升溫要高2-4℃，這可能是由于每個聚甲基鏈的電子密度和空間位阻的差異所致,。

骨靶向近紅外熒光團物理化學穩(wěn)定性的測量：作者分別在DI水中制備1mM和5μM工作液,，測定P800SO3-PEG的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性。P800SO3-PEG在-80~25°C的廣泛溫度范圍內孵育8小時后顯示了合理的熱穩(wěn)定性,。

鈣鹽結合試驗：作者進一步測量了NIR-I和NIR-II窗口（圖2a）中NIR熒光團的熒光發(fā)射尾部,，然后體外測試這些熒光基團結合生物相關鈣鹽的能力，包括羥基磷灰石（HA）,、碳酸鈣（CC）,、磷酸鈣（CP）、草酸鈣（CO）和焦磷酸鈣（CPP）,。在人體內發(fā)現(xiàn)的五種主要鈣鹽中,，HA是主要成分，也存在于動脈粥樣硬化斑塊和骨腫瘤中,。通常,，在測定中，沒有熒光基團與CPP表現(xiàn)出強烈的結合,。與其他3種熒光基團相比,，P800SO3-Cl在NIR-I和近紅外-II窗口內與HA的結合力更強，但其在HA,、CC,、CP和CO之間的結合差異很小?？傮w而言,，NIR-II窗口中骨靶向藥物的信號強度比NIR-I窗口中的信號強度高十倍。為了找到更詳細的與鈣鹽的結合模式和形態(tài),，選擇P800SO3-PEG并在近紅外顯微鏡下觀察,。如圖4所示，在HA,、CP和CO中觀察到較強的信號,，但在CPP中幾乎沒有觀察到任何信號，表明結合zui小,，這與圖2b中的體外數(shù)據(jù)一致,。

圖2

骨特異性靶向：作者為了評估骨特異性結合以及生物分布和清除率，將50 nmol的每種NIR熒光團靜脈內施用于CD-1小鼠,，并在NIR-I和NIR-II窗口下成像,，直到注射后4小時（如圖3所示）。在成像之前，所有內臟器官都被切除,，仰臥姿勢被固定,。所有注射的NIR熒光團都成功地突出了小鼠的胸椎，腰椎和骶椎,，以及脊髓肋骨,，髂骨和膝關節(jié)，具有高熒光信號（圖3a,，b）,。P800SO3-Cl的LogD值相對較高，對HA的結合選擇性較差,，因此在肌肉和皮膚中表現(xiàn)出較高的非特異性攝取,，導致三者中的SBRzui低（NIR-I≈2.3，NIR-II≈3.9）,。另一方面,，P800SO3-SH由于在低濃度（<50μM）下光穩(wěn)定性差，因此在骨骼和背景組織中顯示出整體低信號,。P800SO3-PEG呈現(xiàn)出zui小的背景信號,，整個骨骼結構清晰地凸顯出來。

圖3

生物分布和藥代動力學：作者評估了P800SO3-PEG的藥代動力學和排泄途徑（圖4a）,。P800SO3-PEG迅速分布到全身,，并迅速從血液中清除。不像P800SO3,，P800SO3的間隙較慢,。因此，P800SO3-PEG在曲線下顯示小面積（AUC）和合理的清除率（0.23 mL / min）,，導致4小時內快速排泄尿（74%ID）,。

無chuangNIR-II成像：在NIR-II窗口中，在測試的劑量范圍內清楚地檢測到顱骨,，肩胛骨,，脊柱，髂骨和部分股骨,。在50nmol的劑量下獲得22.0±1.3的zui大平均SBR值,。P800SO3-PEG通過腎臟清除進入膀胱而從體內消除，即使在zui高劑量為100 nmol的情況下,，非骨組織也不會對其進行非特異性攝取。圖4c比較了靜脈注射P800SO3-PEG后小鼠1天和14天的膝蓋,，顱骨,，脊柱和尾巴的骨成像。放大的骨圖像顯示了組織中骨信號分布的變化。在膝關節(jié)中,，骨骺和形骺是代謝活躍的區(qū)域,，信號隨著時間的推移而減少或消失，并重新分布到脛骨和股骨中,。另一方面,，生長板中沒有信號，因為它是軟骨組織,。至于顱骨和上頜骨,，隨著時間的推移，邊緣輪廓信號變得更加明顯,。后軀干的平面形狀顯示脊柱（包括胸椎,、腰椎和骶椎）、髂骨和部分背肋骨,。在NIR-II窗口下,，棘突中的信號逐漸減少，而橫向過程中的信號被保留,。圖4c還顯示了非皮膚小鼠的精確尾椎成像,。經(jīng)過兩周的沉積，每個尾錐都發(fā)出高信號強度,，并且可以在視覺上分離,。椎間盤中沒有熒光信號，因為它是纖維軟骨組織,。第1天對縱向骨骼的H&E和顯微分析顯示骨表面的熒光信號（圖4d）表明軟骨（白色箭頭）,，注射后第14天的成像顯示P800SO3-PEG穩(wěn)定地摻入骨基質（黃色箭頭），隨著時間的推移,，額外的正常骨基質沉積在NIR熒光團的頂部,。對松質骨的顯微鏡分析表明，該區(qū)域的周轉率很高（即去除P800SO3-PEG標記的組織（藍色虛線）和/或延遲新骨沉積（無熒光）,。

圖4

3D熒光層析成像：計算機斷層掃描（CT）是zui常見的成像方法,，廣泛用于在宏觀和微觀水平上提供骨骼圖像。此外,，由于廣角（360°）采集熒光數(shù)據(jù),，3D熒光斷層掃描提供了查看深層組織NIR熒光成像的機會。熒光發(fā)射計算機斷層掃描（FLECT）/CT系統(tǒng)通過采集動物主體周圍的360°投影圖像并隨后進行精確的圖像重建,，可以捕獲真實的3D斷層掃描圖像,。圖5顯示了在InSyTe FLECT / CT成像系統(tǒng)下通過3D熒光斷層掃描P800SO3-PEG在各種骨組織中的體內分布。與其他組織相比,，P800SO3-PEG在注射后4 d顯示出明顯的骨攝取,。圖5a顯示了P800SO3-PEG在脊柱和骨關節(jié)中的積累,。該數(shù)據(jù)還表明P800SO3-PEG優(yōu)先積累在代謝活躍的骨骼區(qū)域。殘余微弱的腎臟信號表明P800SO3-PEG的腎清除率穩(wěn)定,。冠狀動脈和矢狀面圖像還顯示P800SO3-PEG在膝蓋,，肩部和脊柱中大量積聚（圖5b，c）,。

圖5

結論:  P800SO3-PEG與骨基質具有高效快速的結合,，并且由于由雙膦酸鹽和磺酸鹽以及柔性硫醇PEG連接劑組成的平衡骨架，腎臟清除率相對較快,。與我們之前報道的骨靶向藥物P800SO3和其他基于雙膦酸鹽的NIR熒光造影劑相比,，P800SO3-PEG具有幾個優(yōu)點：1）通過更高的SBR改善骨特異性靶向。2）zui大吸收和發(fā)射光譜在800nm左右,，與傳統(tǒng)的NIR成像系統(tǒng)兼容,。3）改進了NIR-II窗口下的無chuang成像。4）硫醇誘導的光熱療法治療骨腫瘤,，轉移和傳染病,。此外，與主要保留在體內或顯示緩慢肝膽排泄的典型NIR-II熒光納米顆粒不同,，腎透明P800SO3-PEG顯示出快速排泄和良好的生物相容性,，不會干擾肝臟，脾臟和其他器官,。P800SO3-PEG對骨組織具有較高的親和力,，具有較強的組織成像能力，在主要器官的非特異性吸收zui小,，且具有激光照射下的光熱效應,，是骨靶向治療成像的zui嘉選擇。

參考文獻

doi.org/10.1186/s40824-022-00294-2

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