本文要點(diǎn)：無chuang成像技術(shù)可以用于可視化骨生長(zhǎng)、異常和代謝,，同時(shí)在骨的圖像引導(dǎo)干預(yù)和外科手術(shù)中發(fā)揮著重要作用。然而,，目前還沒有骨特異性NIR-II成像探針,，能夠?qū)崟r(shí)無chuang檢測(cè)骨生長(zhǎng)和組織微鈣化。本研究基于結(jié)構(gòu)固有靶向(SIT)策略,，設(shè)計(jì)靶向近紅外熒光團(tuán)用于骨組織的無chuang成像,，其中靶向基團(tuán)或藥效團(tuán)被納入熒光團(tuán)的化學(xué)結(jié)構(gòu)中。我們對(duì)先前開發(fā)的近紅外熒光團(tuán)進(jìn)行了改進(jìn),，以生成一種腎臟可清除的骨靶向造影劑,。該造影劑具有改進(jìn)的光學(xué)性能和生物分布，此外還能產(chǎn)生光熱效應(yīng)(圖1a),。通過在介碳中引入硫原子,，zui終熒光團(tuán)的峰值發(fā)射波長(zhǎng)轉(zhuǎn)移到NIR-II范圍內(nèi)，對(duì)光照射的敏感性提高,。

背景: 由于NIR-II熒光成像可穿透組織深處并減少散射,，因此在檢測(cè)骨生長(zhǎng)、代謝,、轉(zhuǎn)移及其他骨相關(guān)疾病方面,，NIR-II熒光成像優(yōu)于常規(guī)可見和NIR-I熒光成像。而P800SO3-PEG對(duì)骨組織具有高親和力,，更深的組織成像能力,，其在主要器官中zui小的非特異性攝取以及對(duì)激光照射的光熱效應(yīng)，使其成為骨靶向治療診斷成像的zui嘉選擇,。

方法: 首先,，作者為了研究其穩(wěn)定性與濃度的關(guān)系,，將P800SO3-PEG溶于DI水中，在5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水中制備不同濃度10~250μM的工作溶液,。為了獲得光穩(wěn)定性,，使用808nm激光二極管以35mW/cm2連續(xù)照射200μL的工作溶液，每30分鐘成像一次,，持續(xù)120分鐘,。通過測(cè)量感興趣區(qū)域(ROI)并將熒光強(qiáng)度與起始熒光信號(hào)進(jìn)行比較來確定其穩(wěn)定性。之后作者為了測(cè)定其光熱效應(yīng),，在10mM DMSO染料原液中在1XPBS溶液中制備30μM的ICG,、P800SO3和P800SO3PEG。以PBS作為對(duì)照,。將500μL的工作溶液和空白PBS置于1mL試管中,，用808nm激光二極管以1W/cm2的速度照射2分鐘，用熱成像相機(jī)成像,。每15秒記錄每個(gè)熒光團(tuán)的熱讀數(shù),。

作者隨后做了鈣鹽實(shí)驗(yàn)，將碳酸鈣,、草酸鈣,、羥基磷灰石、磷酸鈣,、焦磷酸鈣鹽(25 mg/mL)分別用5μM工作溶液置于1mL的生理鹽水中孵育,。將鈣鹽與熒光團(tuán)在室溫下連續(xù)旋轉(zhuǎn)30分鐘。然后用生理鹽水洗滌混合物3次,，然后以3000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,，以除去未反應(yīng)的熒光探針。為了比較其結(jié)合親和力,，作者將離心后收集的沉淀分散在200μL的生理鹽水中,，熒光成像系統(tǒng)測(cè)定分散樣品的熒光強(qiáng)度。所有近紅外熒光圖像在相同的曝光時(shí)間下采集,，并以相同的歸一化顯示,。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇了CD-1小鼠(6-8周，雄性)和無體型NCr nu/nu小鼠(6周),。作者為了研究每個(gè)近紅外熒光團(tuán)的生物分布和清除率,，從10mM DMSO原液中提取0.25-1.0mM的含5%牛血清白蛋白(BSA)的生理鹽水配制工作溶液，每個(gè)近紅外熒光團(tuán)100μL(25-100 nmol)經(jīng)眶后竇靜脈注射,，術(shù)中近紅外熒光成像后處死動(dòng)物,，切除主要臟器，包括心,、肺,、肝,、胰、脾,、腎,、十二指腸、腸,、肌肉等,，并成像觀察組織特異性生物分布。每個(gè)器官/肌肉上方感興趣區(qū)域(ROI)的熒光強(qiáng)度使用ImageJ版本1.52 2p進(jìn)行量化,。信背比記為SBR,。

作者為了測(cè)定近紅外熒光團(tuán)的組織分布，在CD-1小鼠注射了50 nmol的P800SO3PEG,，在100μL的5%wt/vBSA/生理鹽水后的第1天和第14天摘除骨組織,。將解剖的組織裁剪并埋入組織-Tek zui嘉切割溫度(OCT)化合物中，不進(jìn)行預(yù)固定步驟,，組織塊在-80℃冷凍,。用低溫制冷機(jī)切割Tµm厚的冷凍切片。玻片*行熒光分析,，然后進(jìn)行蘇木精和伊紅(H&E)染色,。調(diào)整曝光時(shí)間以獲得每個(gè)熒光圖像相似的zui大熒光值。作者還從匹配的視場(chǎng)中獲得了h&e染色玻片的亮場(chǎng)圖像,。

結(jié)果: 骨靶向近紅外熒光團(tuán)的理化性質(zhì)：如圖1b所示，在P800SO3周圍設(shè)計(jì)P800SO3-PEG,，用血清穩(wěn)定但靈活的硫醇PEG連接劑取代根草酸連接劑,，導(dǎo)致zui大吸收光譜和發(fā)射光譜的光束漂移，從而實(shí)現(xiàn)NIR-II尾跡成像,。骨靶向近紅外熒光團(tuán)的理化性質(zhì)見表1,，分布系數(shù)對(duì)數(shù)D是血液中zui終化合物的親脂性和血清蛋白結(jié)合的重要預(yù)測(cè)因子，P800SO3-Cl是親水性的,，但通過在骨架上添加SH或PEG增加了親水性,，這分別將對(duì)數(shù)D降低到-7.04和-8.65。而拓?fù)錁O表面積（TPSA）是組織吸收和滲透的指標(biāo),。而表2總結(jié)了在10%胎牛血清(FBS)中測(cè)定的骨靶向近紅外熒光團(tuán)的光學(xué)性質(zhì),，P800SO3-Cl在817 nm處熒光zui強(qiáng)，消光系數(shù)高,。在同一七甲基氨酸主鏈的中碳上,，氧取代導(dǎo)致熒光發(fā)射的低色移，而硫原子取代產(chǎn)生42-45 nm的淺色移，從而實(shí)現(xiàn)了NIR-II尾成像(圖1e,f),。

圖1

表1

骨靶向近紅外熒光團(tuán)的血漿蛋白結(jié)合,，光穩(wěn)定性和光熱效應(yīng)：首先是骨靶向近紅外熒光團(tuán)的血清穩(wěn)定性,，作者使用快速平衡透析(RED)裝置測(cè)量了它們的血漿蛋白結(jié)合(PPB)(圖1g),。在濃度為10µM的5%含牛血清白蛋白(BSA)生理鹽水中制備近紅外熒光團(tuán),，在37°C溫和振蕩孵育8h,。利用ICG作為對(duì)照,。P800SO3-Cl和P800SO3-PEG顯示約40%的PPB,，而P800SO3和P800SO3-SH顯著結(jié)合血漿蛋白(>70%),。作者為了測(cè)量了這些近紅外熒光團(tuán)在不同濃度(10-100μM)下的光穩(wěn)定性，在自制的NIR-II成像系統(tǒng)下,，使用功率密度為35mW/cm2的808nm激光照射2h,，P800SO3和P800SO3Cl在>50µM時(shí)表現(xiàn)出較好的光穩(wěn)定性。然后,，作者在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中固定每個(gè)熒光團(tuán)的濃度為30μM,，并在808 nm激光下照射樣品2分鐘，以證明其假設(shè),，這些近紅外熒光團(tuán)顯示光熱效應(yīng)如圖1h所示,。總的來說,，在激光照射下,，所有測(cè)試的近紅外熒光團(tuán)都觀察到升高的溫度變化(10-15°C)。其中,，P800SO3-PEG和P800SO3-SH表現(xiàn)出zui快的光熱效應(yīng),，這與圖S3a中它們的光敏性結(jié)果一致。與P800SO3相比,，P800SO3- peg的升溫要高2-4℃,，這可能是由于每個(gè)聚甲基鏈的電子密度和空間位阻的差異所致。

骨靶向近紅外熒光團(tuán)物理化學(xué)穩(wěn)定性的測(cè)量：作者分別在DI水中制備1mM和5μM工作液,，測(cè)定P800SO3-PEG的熱穩(wěn)定性和pH穩(wěn)定性,。P800SO3-PEG在-80~25°C的廣泛溫度范圍內(nèi)孵育8小時(shí)后顯示了合理的熱穩(wěn)定性。

鈣鹽結(jié)合試驗(yàn)：作者進(jìn)一步測(cè)量了NIR-I和NIR-II窗口（圖2a）中NIR熒光團(tuán)的熒光發(fā)射尾部,，然后體外測(cè)試這些熒光基團(tuán)結(jié)合生物相關(guān)鈣鹽的能力,，包括羥基磷灰石（HA）、碳酸鈣（CC）,、磷酸鈣（CP）,、草酸鈣（CO）和焦磷酸鈣（CPP）。在人體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的五種主要鈣鹽中,，HA是主要成分,，也存在于動(dòng)脈粥樣硬化斑塊和骨腫瘤中。通常，在測(cè)定中,，沒有熒光基團(tuán)與CPP表現(xiàn)出強(qiáng)烈的結(jié)合,。與其他3種熒光基團(tuán)相比，P800SO3-Cl在NIR-I和近紅外-II窗口內(nèi)與HA的結(jié)合力更強(qiáng),，但其在HA,、CC、CP和CO之間的結(jié)合差異很小,?？傮w而言，NIR-II窗口中骨靶向藥物的信號(hào)強(qiáng)度比NIR-I窗口中的信號(hào)強(qiáng)度高十倍,。為了找到更詳細(xì)的與鈣鹽的結(jié)合模式和形態(tài),，選擇P800SO3-PEG并在近紅外顯微鏡下觀察。如圖4所示,，在HA,、CP和CO中觀察到較強(qiáng)的信號(hào)，但在CPP中幾乎沒有觀察到任何信號(hào),，表明結(jié)合zui小,，這與圖2b中的體外數(shù)據(jù)一致。

圖2

骨特異性靶向：作者為了評(píng)估骨特異性結(jié)合以及生物分布和清除率,，將50 nmol的每種NIR熒光團(tuán)靜脈內(nèi)施用于CD-1小鼠,，并在NIR-I和NIR-II窗口下成像，直到注射后4小時(shí)（如圖3所示）,。在成像之前,，所有內(nèi)臟器官都被切除，仰臥姿勢(shì)被固定,。所有注射的NIR熒光團(tuán)都成功地突出了小鼠的胸椎,，腰椎和骶椎，以及脊髓肋骨,，髂骨和膝關(guān)節(jié)，具有高熒光信號(hào)（圖3a,，b）,。P800SO3-Cl的LogD值相對(duì)較高，對(duì)HA的結(jié)合選擇性較差,，因此在肌肉和皮膚中表現(xiàn)出較高的非特異性攝取,，導(dǎo)致三者中的SBRzui低（NIR-I≈2.3，NIR-II≈3.9）,。另一方面,，P800SO3-SH由于在低濃度（<50μM）下光穩(wěn)定性差，因此在骨骼和背景組織中顯示出整體低信號(hào),。P800SO3-PEG呈現(xiàn)出zui小的背景信號(hào),，整個(gè)骨骼結(jié)構(gòu)清晰地凸顯出來,。

圖3

生物分布和藥代動(dòng)力學(xué)：作者評(píng)估了P800SO3-PEG的藥代動(dòng)力學(xué)和排泄途徑（圖4a）。P800SO3-PEG迅速分布到全身,，并迅速從血液中清除,。不像P800SO3，P800SO3的間隙較慢,。因此,，P800SO3-PEG在曲線下顯示小面積（AUC）和合理的清除率（0.23 mL / min），導(dǎo)致4小時(shí)內(nèi)快速排泄尿（74%ID）,。

無chuangNIR-II成像：在NIR-II窗口中,，在測(cè)試的劑量范圍內(nèi)清楚地檢測(cè)到顱骨，肩胛骨,，脊柱,，髂骨和部分股骨。在50nmol的劑量下獲得22.0±1.3的zui大平均SBR值,。P800SO3-PEG通過腎臟清除進(jìn)入膀胱而從體內(nèi)消除,，即使在zui高劑量為100 nmol的情況下，非骨組織也不會(huì)對(duì)其進(jìn)行非特異性攝取,。圖4c比較了靜脈注射P800SO3-PEG后小鼠1天和14天的膝蓋,，顱骨，脊柱和尾巴的骨成像,。放大的骨圖像顯示了組織中骨信號(hào)分布的變化,。在膝關(guān)節(jié)中，骨骺和形骺是代謝活躍的區(qū)域,，信號(hào)隨著時(shí)間的推移而減少或消失,，并重新分布到脛骨和股骨中。另一方面,，生長(zhǎng)板中沒有信號(hào),，因?yàn)樗擒浌墙M織。至于顱骨和上頜骨,，隨著時(shí)間的推移,，邊緣輪廓信號(hào)變得更加明顯。后軀干的平面形狀顯示脊柱（包括胸椎,、腰椎和骶椎）,、髂骨和部分背肋骨。在NIR-II窗口下,，棘突中的信號(hào)逐漸減少,，而橫向過程中的信號(hào)被保留。圖4c還顯示了非皮膚小鼠的精確尾椎成像。經(jīng)過兩周的沉積,，每個(gè)尾錐都發(fā)出高信號(hào)強(qiáng)度,，并且可以在視覺上分離。椎間盤中沒有熒光信號(hào),，因?yàn)樗抢w維軟骨組織,。第1天對(duì)縱向骨骼的H&E和顯微分析顯示骨表面的熒光信號(hào)（圖4d）表明軟骨（白色箭頭），注射后第14天的成像顯示P800SO3-PEG穩(wěn)定地?fù)饺牍腔|(zhì)（黃色箭頭）,，隨著時(shí)間的推移,，額外的正常骨基質(zhì)沉積在NIR熒光團(tuán)的頂部。對(duì)松質(zhì)骨的顯微鏡分析表明,，該區(qū)域的周轉(zhuǎn)率很高（即去除P800SO3-PEG標(biāo)記的組織（藍(lán)色虛線）和/或延遲新骨沉積（無熒光）,。

圖4

3D熒光層析成像：計(jì)算機(jī)斷層掃描（CT）是zui常見的成像方法，廣泛用于在宏觀和微觀水平上提供骨骼圖像,。此外,，由于廣角（360°）采集熒光數(shù)據(jù)，3D熒光斷層掃描提供了查看深層組織NIR熒光成像的機(jī)會(huì),。熒光發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描（FLECT）/CT系統(tǒng)通過采集動(dòng)物主體周圍的360°投影圖像并隨后進(jìn)行精確的圖像重建,，可以捕獲真實(shí)的3D斷層掃描圖像。圖5顯示了在InSyTe FLECT / CT成像系統(tǒng)下通過3D熒光斷層掃描P800SO3-PEG在各種骨組織中的體內(nèi)分布,。與其他組織相比,，P800SO3-PEG在注射后4 d顯示出明顯的骨攝取。圖5a顯示了P800SO3-PEG在脊柱和骨關(guān)節(jié)中的積累,。該數(shù)據(jù)還表明P800SO3-PEG優(yōu)先積累在代謝活躍的骨骼區(qū)域,。殘余微弱的腎臟信號(hào)表明P800SO3-PEG的腎清除率穩(wěn)定。冠狀動(dòng)脈和矢狀面圖像還顯示P800SO3-PEG在膝蓋,，肩部和脊柱中大量積聚（圖5b,，c）。

圖5

結(jié)論:  P800SO3-PEG與骨基質(zhì)具有高效快速的結(jié)合,，并且由于由雙膦酸鹽和磺酸鹽以及柔性硫醇PEG連接劑組成的平衡骨架,，腎臟清除率相對(duì)較快。與我們之前報(bào)道的骨靶向藥物P800SO3和其他基于雙膦酸鹽的NIR熒光造影劑相比,，P800SO3-PEG具有幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：1）通過更高的SBR改善骨特異性靶向,。2）zui大吸收和發(fā)射光譜在800nm左右，與傳統(tǒng)的NIR成像系統(tǒng)兼容,。3）改進(jìn)了NIR-II窗口下的無chuang成像。4）硫醇誘導(dǎo)的光熱療法治療骨腫瘤,，轉(zhuǎn)移和傳染病,。此外，與主要保留在體內(nèi)或顯示緩慢肝膽排泄的典型NIR-II熒光納米顆粒不同，腎透明P800SO3-PEG顯示出快速排泄和良好的生物相容性,，不會(huì)干擾肝臟,，脾臟和其他器官。P800SO3-PEG對(duì)骨組織具有較高的親和力,，具有較強(qiáng)的組織成像能力,，在主要器官的非特異性吸收zui小，且具有激光照射下的光熱效應(yīng),，是骨靶向治療成像的zui嘉選擇,。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1186/s40824-022-00294-2

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