本文要點(diǎn)：光熱療法(PTT)是一種通過局部熱療誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死的非侵入性治療方法,，具有有效腫瘤殺傷力，但是NIR-II PTT治療作用的增加依賴于非輻射衰減,，這會(huì)犧牲熒光(FL)生物成像的熒光亮度。本文合成了四種NIR-II黃蒽染料(CL1-CL4)，在1064nm激發(fā)下,，zuida發(fā)射波長(zhǎng)超過1200nm。其中,，CL4與FBS絡(luò)合后熒光量子產(chǎn)率zuida,，能夠清晰分辨出腫瘤血管，而且光熱轉(zhuǎn)換率（PCE）高達(dá)36%,，可用于PTT治療,，成功在NIR-II窗口實(shí)現(xiàn)熒光成像和光熱治療在的平衡利用。

方案1：CL4/FBS的構(gòu)建示意圖,、平衡利用熒光和光熱用于腫瘤血管造影和光熱治療,。

CL4與FBS絡(luò)合后，在1064nm的激光照射下,，可以同時(shí)實(shí)現(xiàn)在NIR-II窗口中的熒光成像和PTT治療,。

圖1：a) CLs的分子結(jié)構(gòu)。b) CLs的HOMO軌道和LUMO軌道。c)通過密度泛函理論(DFT)計(jì)算優(yōu)化CLs的幾何形狀,。d)CLs在氯仿中的吸收光譜,。e)氯仿中CLs在1064 nm激發(fā)下的歸一化發(fā)射光譜。

表1：CLs的光物理性質(zhì)和DFT計(jì)算

首先,，研究CLs的光譜性質(zhì),。CLs在1200 nm附近有較寬的吸收帶，并且在1064nm的激發(fā)下,，CLs的zuida發(fā)射波長(zhǎng)均超過1200 nm (表1,、圖1d和1e)。這主要?dú)w因于兩個(gè)氧雜蒽核與聚甲基橋的融合,，導(dǎo)致分子內(nèi)電荷轉(zhuǎn)移(ICT)效應(yīng)顯著增強(qiáng),。其中CL4具有zuida的Egap、分子扭曲和熒光量子產(chǎn)率(圖1b,、1c和表1),。這是因?yàn)閷F3引入巰基的鄰位，導(dǎo)致分子內(nèi)空間位阻大,，削弱了分子的自由旋轉(zhuǎn),，增加了輻射衰減。

圖2：a) CL4與FBS在1064nm激發(fā)下孵育0-120 min,，隨時(shí)間變化的發(fā)射光譜,。b) CLs與FBS孵育0-120分鐘，CL2 ~ CL4熒光強(qiáng)度的變化,。c-d) CL4/FBS和CL4-水的吸收光譜(c)和發(fā)射光譜(d),。e) CL4/ FBS的透射電鏡(TEM)圖像。f-g) CL4/FBS和FBS的水動(dòng)力直徑(f)和zeta電位(g),。h) CL4/FBS的pH穩(wěn)定性,。i) CL4/FBS和ICG 的光穩(wěn)定性。

接下來,，研究CLs/FBS的性質(zhì),。將CLs與FBS絡(luò)合，可以提高自身的熒光強(qiáng)度和親水性,。如圖2b-2d所示,，與FBS絡(luò)合后，CLs的zuida吸收波長(zhǎng)發(fā)生紅移,，zuida發(fā)射波長(zhǎng)略微藍(lán)移,，其中CL4的熒光強(qiáng)度比CL2或CL3提高了3倍以上，這可能歸因于CL4的分子內(nèi)旋轉(zhuǎn)容易受到限制,。接著進(jìn)一步表征CLs/FBS的基本性質(zhì),，如圖2e-2g所示,，CL4/FBS的粒徑均勻，TEM測(cè)定的粒徑約為40nm,，DLS測(cè)得的粒徑為64nm,；并且CL4/FBS的電動(dòng)電勢(shì)與FBS相當(dāng)。這些結(jié)果表明CLs/FBS具有通過高滲透長(zhǎng)滯留(EPR)效應(yīng)實(shí)現(xiàn)被動(dòng)靶向腫瘤的可能性,。此外，CL4/FBS還具有PH穩(wěn)定性和光穩(wěn)定性(圖2h和圖2i),。

圖3：a) CL4/FBS在1064 nm激光照射下的升溫曲線,。b)冷卻時(shí)間與的線性關(guān)系。c)在不同時(shí)間下,，CL4/FBS隨著濃度變化的溫度曲線,。d)在1064 nm激光照射10分鐘后，CL4/FBS濃度依賴性的熱圖像,。e)在不同激光功率下,，CL4/FBS隨時(shí)間變化的溫度曲線。f)在不同激光功率連續(xù)照射30 min下,，CL4/FBS的光穩(wěn)定性,。g) CL4/FBS在5個(gè)加熱-冷卻循環(huán)中的光熱穩(wěn)定性。

接著,，研究CL4/FBS的光熱性能,。如圖3a-3b所示，CL4/FBS的PCE高達(dá)36%,，而CL4在水中的PCE僅為19%,，所以與FBS絡(luò)合不僅提高熒光強(qiáng)度，也提高了PTT的治療效果,。如圖3c-3d所示,，在同樣條件激光照射下，水溫度只升高了9.8℃,，而CL4/FBS溫度上升更顯著,，并且表現(xiàn)出濃度依賴性。同樣,，隨著激光功率的增加,，CL4/FBS溶液溫度也隨之增加(圖3e)。這些結(jié)果都表明了CL4/FBS具有良好的體外光熱性能,。另外,，CL4/FBS還具有良好的光熱穩(wěn)定性(圖3f和3g)，可以繼續(xù)進(jìn)一步PTT的體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn),。

圖4：a) 4T1細(xì)胞與CL4/FBS孵育4 h后,，明場(chǎng),、核染色和 NIR-II FL的圖像。b) 與CL4/FBS孵育,，無/有激光照射的4T1細(xì)胞的存活率,。c)不同條件下活/死細(xì)胞共染色的共聚焦圖像。

緊接著,，在體外研究CL4/FBS的PTT效果,。首先研究CL4/FBS的細(xì)胞攝取，如圖4a所示,，與CL4/FBS孵育4h之后,，4T1細(xì)胞中可觀察到明亮的NIR-II熒光，而細(xì)胞核中沒有發(fā)現(xiàn)熒光,，說明CL4/FBS具有良好的細(xì)胞攝取能力,。隨后研究CL4/FBS的細(xì)胞毒性，如圖4b所示,，CL4/FBS具有良好的生物相容性,，而與CL4/FBS孵育并在激光照射下4T1細(xì)胞的死亡率逐漸增加，說明CL4/FBS具有出色的激光觸發(fā)的熱效應(yīng),。另外,，如圖4c所示，只有PTT組,，表現(xiàn)出明顯的紅色熒光,，說明細(xì)胞被有效殺滅。這些結(jié)果表明,，CL4/FBS具有良好的光熱治療效果,。

圖5：a）靜脈注射CL4/FBS后0、20,、30,、40min腫瘤血管的NIR-II FL。b-d）(a)中線1,、線2和線3橫截面的強(qiáng)度分布圖,。e)靜脈注射CL4/FBS后，(a)中A區(qū)和B區(qū)分別在20,、30和40 min的平均熒光強(qiáng)度,。

接下來，通過NIR-II FL研究腫瘤血管最基本的性質(zhì)?，F(xiàn)有的非侵入性成像方法難以獲得腫瘤血管的本質(zhì)特征,。然而如圖5a所示，靜脈注射CL4/FBS后,，腫瘤血管清晰明亮,。線1和線2是腫瘤血管的橫切面,，線3是正常血管的橫切面，對(duì)比它們的半峰寬(FWHM),，可以看出在腫瘤發(fā)生的前期的血管比正常血管要細(xì)得多(5b-5d),。另外，如圖5e所示,，A區(qū)的熒光強(qiáng)度低于B區(qū),，這歸因于腫瘤血管的異常滲漏結(jié)構(gòu)，表明腫瘤穿透具有復(fù)雜的異質(zhì)性,。這些結(jié)果表明CL4/FBS具有良好的NIR-II腫瘤血管造影的能力,。

圖6：a) 4T1荷瘤小鼠靜脈注射CL4/FBS和CL4后全身NIR-II 熒光成像，以及不同時(shí)間靜脈注射CL4/FBS后腫瘤的放大圖,。b) (a)中腫瘤NIR-II FL強(qiáng)度的量化。c) 靜脈注射CL4/FBS和CL4 48小時(shí)后,，主要器官和腫瘤離體NIR-II的熒光成像,。d）(c)中主要器官和腫瘤強(qiáng)度的量化。

接下來,，研究CL4/FBS在腫瘤中的富集,。如圖6a-6b所示，靜脈注射CL4/FBS后,，腫瘤亮度逐漸升高,，注射32 h后腫瘤亮度zuida，而靜脈注射CL4后,，在腫瘤部位幾乎沒有觀察到NIR-II熒光,。之后研究小鼠的主要器官和腫瘤，發(fā)現(xiàn)CL4/FBS比CL4更有效地在腫瘤中富集,；此外,，CL4/FBS和CL4在肝臟和脾臟均有積累，表明可能它們?cè)隗w內(nèi)的代謝途徑是肝膽系統(tǒng)(圖6c-d),。這些結(jié)果表明CL4/FBS可作為一種有效的NIR-II熒光劑用于腫瘤成像,。

圖7：a）激光組和PTT組隨時(shí)間變化的小鼠時(shí)間分辨紅外熱像圖。b）不同組別腫瘤溫度變化,。c）不同治療后14 天內(nèi)小鼠腫瘤體積的變化,。d）不同處理后第0天和第14天的小鼠照片。e）第14天腫瘤的照片,。f）第14天腫瘤的重量,。g）不同處理14天后的小鼠體重。h）不同治療后腫瘤切片的H&E,、Ki67,、TUNEL染色圖像,。

最后，進(jìn)行體內(nèi)NIR-II PTT研究,。按治療方式分為4組:①對(duì)照組,；②CL4/FBS組；③激光組;④PTT組,。如圖7a-7b所示,，PTT組腫瘤溫度迅速升高，而其他組腫瘤溫度沒有明顯變化,。接著,，檢測(cè)腫瘤的體積和重量，發(fā)現(xiàn)只有PTT組的腫瘤生長(zhǎng)明顯受到抑制(圖7c-7f),。說明CL4/FBS的PTT具有良好的腫瘤抑制活性,。并且如圖7g所示，在治療期間,，各組小鼠體重變化可以忽略不計(jì),，說明各組都沒有明顯不良反應(yīng)。接下來,，進(jìn)一步探討PTT對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制機(jī)制,，如圖7h所示，PTT組腫瘤組織H&E染色圖像顯示出腫瘤細(xì)胞嚴(yán)重凋亡和壞死,，Ki67和TUNEL免疫熒光染色圖像顯示了腫瘤細(xì)胞輕度增殖和明顯的凋亡信號(hào),，結(jié)果證實(shí)了CL4/FBS的PTT對(duì)腫瘤有較好的抑制作用。

總結(jié)：作者合成了4種發(fā)射波長(zhǎng)超過1200 nm的NIR-II新型黃蒽染料CLs,。其中CL4與FBS絡(luò)合后,，具有zuiqiang的熒光強(qiáng)度和zuigao的PCE。在NIR-II FL成像中,，可以清晰呈現(xiàn)出腫瘤血管,，并且可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)，成功實(shí)現(xiàn)了平衡利用熒光成像和PTT治療,。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1002/smll.202202078.

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