本文要點：xinguan病毒（SARS-CoV-2）的早期發(fā)現(xiàn)是預(yù)防其傳播的有效途徑,。xinguan病毒抗原檢測是便捷的方法,，但如何發(fā)展高靈敏度的有效診斷方法仍是一個挑戰(zhàn)。本文提出了一種基于近紅外二區(qū)窗口熒光發(fā)射納米顆粒的橫向流動分析方法( lateral flow assay,，LFA),，用于xinguan病毒抗原的靈敏檢測。得益于NIR-II熒光的高穿透性和低自體熒光,，這種NIR-ⅡLFA可以增強SBR,，使得SARS-CoV-2抗原的檢測限可降至0.01 ng·mL-1。在臨床拭子樣本測試中,，NIR-II LFA優(yōu)于膠體金LFA,，與聚合酶鏈反應(yīng)測試的總體一致性更高。NIR-II LFA可以成功檢測低抗原濃度(0.015 ~ 0.068 ng·mL-1)的臨床標本，而膠體金LFA檢測失敗,。NIR-II LFA可為xinguan病毒感染的早期診斷和大規(guī)模篩查提供一個高靈敏度,、快速、經(jīng)濟有效的平臺,。

NIR-II熒光納米顆粒是通過將有機染料封裝在聚苯乙烯(PS)納米顆粒中制備的,。納米顆粒表面修飾的羧基，允許與胺功能化的單克隆抗體(mAbs117)進行偶聯(lián),。與mAbs117偶聯(lián)后,，納米顆粒(NIR-II nanoparticles@mAbs117)尺寸增大47 nm、表面變粗糙(Figure 1(a)),。制備的納米顆粒分散在水中呈淡綠色,，并顯示明亮的NIR-II熒光(Figure 1(b))。其紫外-可見-近紅外(UV-Vis-NIR)吸收光譜在806 nm處出現(xiàn)峰值,，而熒光發(fā)射光譜在1046 nm處出現(xiàn)峰值(Figure 1(c))。

納米顆粒對于xinguan病毒抗原進行LFA檢測的原理如Figure 2 所示,。LFA條帶由5部分組成:樣品墊（Sample pad）,、結(jié)合墊（Conjugate pad）、NC膜（NC membrane）,、吸收墊（Absorbent pad）和塑料襯底（Plastic backing）,。NIR-II nanoparticles@mAbs117被固定在結(jié)合墊上。將N蛋白捕獲抗體(mAbs30)和鏈霉親和素分別置于NC膜上的測試線(T線)和控制線(C線)上,，T線和C線之間的間隙約為3 mm,。樣品液被滴加到樣品墊上后，在毛細力作用下流向吸收墊,。在流動過程中,，樣品中xinguan病毒N蛋白將與結(jié)合墊上的nanoparticles@mAbs117形成 nanoparticles@SARS-CoV-2 N蛋白復合物。由于xinguan病毒N蛋白與mAbs30之間的抗原抗體相互作用,，該復合物在T線上被mAbs30抗體捕獲,，形成三明治免疫復合物結(jié)構(gòu)。樣品中N蛋白越多,，在試驗線上聚集的夾心免疫復合物越多,。隨著樣品繼續(xù)流動，生物素標記的nanoparticles@mAbs117被鏈霉親和素捕獲在C線上,。在808 nm激發(fā)并在1000 nm長通濾波器濾波后,，可使用低成本的InGaAs光電探測器在室溫下記錄熒光信號。熒光信號與納米顆粒的數(shù)量呈正相關(guān),。通過對T線和C線的熒光信號強度積分,，建立抗原濃度與熒光強度的對應(yīng)關(guān)系，可以得到定量的樣品濃度?；诖嗽?，建立了一種高靈敏度的SARS-CoV-2抗原橫向流動檢測方法，可用于SARS-CoV-2抗原的定量早期診斷,。

優(yōu)化篩選出NIR-II nanoparticles@mAbs117的抗體載量和免疫測定時間為240 ng·mL-1和15min,。隨后，通過檢測不同濃度的xinguan病毒重組抗原,，評估LFA的靈敏度,。隨著N蛋白濃度的增加，T/C信號強度相應(yīng)增加(Figure 3(a)),。T/C強度與N蛋白濃度在0.02-120 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,。在檢測閾值附近進行了一系列低濃度實驗。通過空白加三倍標準差的平均信號強度計算,，LoD降至0.01 ng·mL-1(Figure 3(b)),。再現(xiàn)性是評價方法有效性的關(guān)鍵因素。在N蛋白濃度為0.5,、10和100 ng·mL-1時,，回收率估計分別為102.6%、98.9%和109.1%(Figure 3(c)),。通過檢測甲型流感,、乙型流感、S蛋白(SARS-CoV-2重組刺突蛋白)和N蛋白,，驗證了條帶的特異性,。結(jié)果表明，本研究的條帶可以特異性識別xinguan病毒,，并且與其他蛋白沒有交叉反應(yīng)(Figure 3(d)),。

從低抗原濃度的檢測中發(fā)現(xiàn)，T線與背景信號區(qū)分明顯：當抗原濃度降低到0.1 ng·mL-1時,，SBR高達3.46,；當抗原濃度低至0.01 ng·mL-1時，SBR仍可達到1.21,，但T線看起來比較模糊(Figure 4(a)),。與商業(yè)膠體金分析試劑盒進行比較，在用相同抗體制備的膠體金檢測試劑盒中：當抗原濃度稀釋到0.1 ng·mL-1時,，T線不明顯,；而0.5 ng·mL-1時SBR僅為1.23(Figure 4(b))。另一種商業(yè)膠體金型xinguan病毒抗原試劑盒,，當抗原濃度稀釋至0.5 ng·mL-1時,，T線不清晰。結(jié)果提示NIR-II LFA檢測xinguan病毒抗原的敏感性高于膠體金LFA。

為進一步驗證NIR-II LFA的有效性,，研究采集了30份臨床拭子樣本,，包括18份coviD-nineteen陽性樣本和12份coviD-nineteen陰性樣本(由深圳疾病預(yù)防控制中心PCR證實)。通過比較熒光強度分布曲線可以清楚地區(qū)分陽性樣品和陰性樣品,。其中10例抗原濃度較低,，范圍為0.015 ~ 0.068 ng·mL-1(Figure 5(a))。我們測試了相同條件下膠體金檢測方法 (WWHS Biotech, Inc.),。18份陽性樣本中僅檢出8例抗原濃度較高的病例(Figure 5(b)),，其余10例抗原濃度較低無法與陰性樣品區(qū)分。如Figure 5(c)所示,，NIR-II LFA優(yōu)于膠體金LFA,，因為它可以減少假陰性樣品的數(shù)量。需要指出的是,，標本保存液和保存時間可能會影響臨床標本抗原定量的準確性,。目前的結(jié)果表明，NIR-II方法在疑似病例或早期感染的情況下可以實現(xiàn)更敏感的coviD-nineteen檢測,，但仍需要對臨床coviD-nineteen樣本進行更詳細的研究,，以供未來應(yīng)用。

參考文獻

doi.org/10.1007/s12274-022-4351-1

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