本文要點(diǎn)：xinguan病毒（SARS-CoV-2）的早期發(fā)現(xiàn)是預(yù)防其傳播的有效途徑,。xinguan病毒抗原檢測(cè)是便捷的方法,，但如何發(fā)展高靈敏度的有效診斷方法仍是一個(gè)挑戰(zhàn),。本文提出了一種基于近紅外二區(qū)窗口熒光發(fā)射納米顆粒的橫向流動(dòng)分析方法( lateral flow assay，LFA),，用于xinguan病毒抗原的靈敏檢測(cè),。得益于NIR-II熒光的高穿透性和低自體熒光，這種NIR-ⅡLFA可以增強(qiáng)SBR,，使得SARS-CoV-2抗原的檢測(cè)限可降至0.01 ng·mL-1,。在臨床拭子樣本測(cè)試中，NIR-II LFA優(yōu)于膠體金LFA，與聚合酶鏈反應(yīng)測(cè)試的總體一致性更高,。NIR-II LFA可以成功檢測(cè)低抗原濃度(0.015 ~ 0.068 ng·mL-1)的臨床標(biāo)本,，而膠體金LFA檢測(cè)失敗。NIR-II LFA可為xinguan病毒感染的早期診斷和大規(guī)模篩查提供一個(gè)高靈敏度,、快速,、經(jīng)濟(jì)有效的平臺(tái)。

NIR-II熒光納米顆粒是通過將有機(jī)染料封裝在聚苯乙烯(PS)納米顆粒中制備的,。納米顆粒表面修飾的羧基,，允許與胺功能化的單克隆抗體(mAbs117)進(jìn)行偶聯(lián)。與mAbs117偶聯(lián)后,，納米顆粒(NIR-II nanoparticles@mAbs117)尺寸增大47 nm,、表面變粗糙(Figure 1(a))。制備的納米顆粒分散在水中呈淡綠色,，并顯示明亮的NIR-II熒光(Figure 1(b)),。其紫外-可見-近紅外(UV-Vis-NIR)吸收光譜在806 nm處出現(xiàn)峰值，而熒光發(fā)射光譜在1046 nm處出現(xiàn)峰值(Figure 1(c)),。

納米顆粒對(duì)于xinguan病毒抗原進(jìn)行LFA檢測(cè)的原理如Figure 2 所示,。LFA條帶由5部分組成:樣品墊（Sample pad）、結(jié)合墊（Conjugate pad）,、NC膜（NC membrane）,、吸收墊（Absorbent pad）和塑料襯底（Plastic backing）。NIR-II nanoparticles@mAbs117被固定在結(jié)合墊上,。將N蛋白捕獲抗體(mAbs30)和鏈霉親和素分別置于NC膜上的測(cè)試線(T線)和控制線(C線)上,，T線和C線之間的間隙約為3 mm。樣品液被滴加到樣品墊上后,，在毛細(xì)力作用下流向吸收墊,。在流動(dòng)過程中，樣品中xinguan病毒N蛋白將與結(jié)合墊上的nanoparticles@mAbs117形成 nanoparticles@SARS-CoV-2 N蛋白復(fù)合物,。由于xinguan病毒N蛋白與mAbs30之間的抗原抗體相互作用,，該復(fù)合物在T線上被mAbs30抗體捕獲，形成三明治免疫復(fù)合物結(jié)構(gòu),。樣品中N蛋白越多,，在試驗(yàn)線上聚集的夾心免疫復(fù)合物越多。隨著樣品繼續(xù)流動(dòng),，生物素標(biāo)記的nanoparticles@mAbs117被鏈霉親和素捕獲在C線上。在808 nm激發(fā)并在1000 nm長通濾波器濾波后,，可使用低成本的InGaAs光電探測(cè)器在室溫下記錄熒光信號(hào),。熒光信號(hào)與納米顆粒的數(shù)量呈正相關(guān)。通過對(duì)T線和C線的熒光信號(hào)強(qiáng)度積分，建立抗原濃度與熒光強(qiáng)度的對(duì)應(yīng)關(guān)系,，可以得到定量的樣品濃度,。基于此原理,，建立了一種高靈敏度的SARS-CoV-2抗原橫向流動(dòng)檢測(cè)方法,，可用于SARS-CoV-2抗原的定量早期診斷。

優(yōu)化篩選出NIR-II nanoparticles@mAbs117的抗體載量和免疫測(cè)定時(shí)間為240 ng·mL-1和15min,。隨后,，通過檢測(cè)不同濃度的xinguan病毒重組抗原，評(píng)估LFA的靈敏度,。隨著N蛋白濃度的增加,，T/C信號(hào)強(qiáng)度相應(yīng)增加(Figure 3(a))。T/C強(qiáng)度與N蛋白濃度在0.02-120 ng·mL-1范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系,。在檢測(cè)閾值附近進(jìn)行了一系列低濃度實(shí)驗(yàn),。通過空白加三倍標(biāo)準(zhǔn)差的平均信號(hào)強(qiáng)度計(jì)算，LoD降至0.01 ng·mL-1(Figure 3(b)),。再現(xiàn)性是評(píng)價(jià)方法有效性的關(guān)鍵因素,。在N蛋白濃度為0.5、10和100 ng·mL-1時(shí),，回收率估計(jì)分別為102.6%,、98.9%和109.1%(Figure 3(c))。通過檢測(cè)甲型流感,、乙型流感,、S蛋白(SARS-CoV-2重組刺突蛋白)和N蛋白，驗(yàn)證了條帶的特異性,。結(jié)果表明,，本研究的條帶可以特異性識(shí)別xinguan病毒，并且與其他蛋白沒有交叉反應(yīng)(Figure 3(d)),。

從低抗原濃度的檢測(cè)中發(fā)現(xiàn),，T線與背景信號(hào)區(qū)分明顯：當(dāng)抗原濃度降低到0.1 ng·mL-1時(shí)，SBR高達(dá)3.46,；當(dāng)抗原濃度低至0.01 ng·mL-1時(shí),，SBR仍可達(dá)到1.21，但T線看起來比較模糊(Figure 4(a)),。與商業(yè)膠體金分析試劑盒進(jìn)行比較,，在用相同抗體制備的膠體金檢測(cè)試劑盒中：當(dāng)抗原濃度稀釋到0.1 ng·mL-1時(shí)，T線不明顯,；而0.5 ng·mL-1時(shí)SBR僅為1.23(Figure 4(b)),。另一種商業(yè)膠體金型xinguan病毒抗原試劑盒,，當(dāng)抗原濃度稀釋至0.5 ng·mL-1時(shí)，T線不清晰,。結(jié)果提示NIR-II LFA檢測(cè)xinguan病毒抗原的敏感性高于膠體金LFA,。

為進(jìn)一步驗(yàn)證NIR-II LFA的有效性，研究采集了30份臨床拭子樣本,，包括18份coviD-nineteen陽性樣本和12份coviD-nineteen陰性樣本(由深圳疾病預(yù)防控制中心PCR證實(shí)),。通過比較熒光強(qiáng)度分布曲線可以清楚地區(qū)分陽性樣品和陰性樣品。其中10例抗原濃度較低,，范圍為0.015 ~ 0.068 ng·mL-1(Figure 5(a)),。我們測(cè)試了相同條件下膠體金檢測(cè)方法 (WWHS Biotech, Inc.)。18份陽性樣本中僅檢出8例抗原濃度較高的病例(Figure 5(b)),，其余10例抗原濃度較低無法與陰性樣品區(qū)分,。如Figure 5(c)所示，NIR-II LFA優(yōu)于膠體金LFA,，因?yàn)樗梢詼p少假陰性樣品的數(shù)量,。需要指出的是，標(biāo)本保存液和保存時(shí)間可能會(huì)影響臨床標(biāo)本抗原定量的準(zhǔn)確性,。目前的結(jié)果表明,，NIR-II方法在疑似病例或早期感染的情況下可以實(shí)現(xiàn)更敏感的coviD-nineteen檢測(cè)，但仍需要對(duì)臨床coviD-nineteen樣本進(jìn)行更詳細(xì)的研究,，以供未來應(yīng)用,。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1007/s12274-022-4351-1

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近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system

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有不同型號(hào)的樣機(jī)可以測(cè)試,，請(qǐng)聯(lián)系：

艾中凱(博士)

132 6299 1861

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 恒光智影

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