本文要點(diǎn)：食品添加劑在食品生產(chǎn)中是常見的,，在食品加工或準(zhǔn)備過(guò)程中亞硝酸鹽（防腐劑）和胺會(huì)反應(yīng)生成亞硝胺,，亞硝胺是一種劇毒物質(zhì)已知會(huì)引起肝毒性甚至癌癥,。準(zhǔn)確檢測(cè)亞硝胺導(dǎo)致的急性肝損傷有助于制定較好治療方案,，避免病情進(jìn)一步惡化,。本文開發(fā)了一種可激活的探針BHC-LUT，在原位肝臟生物標(biāo)志物H2O2的觸發(fā)下,，可以釋放藥物木犀草素進(jìn)行治療,，同時(shí)形成生色團(tuán)（BHC-OH）用于NIR-II熒光成像和多光譜光聲層析（MOST）成像。近紅外二區(qū)活體成像系統(tǒng) - MARS

以苯并吲哚七甲基菁為生色團(tuán)骨架,，在苯并吲哚基團(tuán)上引入三甘醇,，提高探針的水溶性和生物相容性；通過(guò)硼酸鍵將木犀草素偶聯(lián)到發(fā)色團(tuán)上,，其中硼酸既是H2O2的響應(yīng)基團(tuán),，又是熒光的淬滅劑。當(dāng)探針BHC-Lut通過(guò)靜脈注射到DEN誘導(dǎo)肝損傷的小鼠體內(nèi),，此時(shí)小鼠肝臟中存在H2O2，探針BHC-Lut中硼酸識(shí)別到H2O2,，釋放出藥物木犀草素進(jìn)行治療,，同時(shí)釋放出熒光團(tuán)BHC-OH用于NIR-II熒光成像和MOST成像。

圖1. A）探針BHC-Lut（5μM）與H2O2（0,、5,、10、20、30,、45,、60和80μM）反應(yīng)25min前后的吸收光譜。插圖：830 nm處的吸光度與H2O2濃度的函數(shù)關(guān)系,；B）探針BHC-Lut（20μM）與H2O2（0,、50、100,、120,、200和300μM）反應(yīng)25min前后的熒光光譜。插圖：930nm處的熒光強(qiáng)度與H2O2濃度的函數(shù)關(guān)系,；C）探針BHC-Lut（20μM）在不同時(shí)間（0,、1、3,、6,、10、15,、20和25min）與H2O2（300μM）反應(yīng)后的熒光光譜,。插圖：930 nm處的熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化；D）探針BHC-Lut（20μM）的相對(duì)OA強(qiáng)度與H2O2水平(0,、20,、40、80,、160,、320μM)之間的關(guān)系。插圖：探針BHC-Lut與不同水平的H2O2反應(yīng)后的光聲圖像,；E）探針BHC-Lut（10μM）中與不同劑量的H2O2作用不同時(shí)間（0,，5，10,，20,，40，60,，80min）前后木犀草素的累積釋放百分比,；F）探針BHC-Lut（20μM）在不同生物相關(guān)物質(zhì)中熒光強(qiáng)度（930 nm）的比率。a.空白,，b.H2O2（300μM）,，c.谷胱甘肽（1mM），d.半胱氨酸（1mM）,，e. L-異亮氨酸（1mM）,，f.谷氨酸（1mM）,，g.酪氨酸（1mM），h.丙氨酸（1mM）,，i.葡萄糖（1mM）,，j.精氨酸（1mM），k.NaNO2（1mM）,，l.NaClO（300μM）,，m. Na+（1mM），n. K+（1mM）,，o. Ca2+（1mM）,，p. Mg2+（1mM）。激發(fā)波長(zhǎng)：808 nm

首先利用光譜測(cè)量研究探針BHC-Lut對(duì)于H2O2的光學(xué)性質(zhì),。如圖1A和1B所示,，在沒有H2O2存在時(shí)，探針BHC-Lut的熒光強(qiáng)度是很低的,；隨著H2O2的水平增加,，探針BHC-Lut的吸光度和熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。另外,，隨著探針BHC-Lut與H2O2反應(yīng)時(shí)間增長(zhǎng),，熒光強(qiáng)度也隨之增強(qiáng)（圖1C）。如圖1D所示,，探針BHC-Lut與不同濃度的H2O2反應(yīng),，隨著H2O2水平增高，探針BHC-Lut的光聲信號(hào)隨著增強(qiáng),。結(jié)果表明探針BHC-Lut可以響應(yīng)H2O2,，并且可以產(chǎn)生用于檢測(cè)H2O2的熒光成像和光聲信號(hào)。

為了評(píng)估通過(guò)響應(yīng)H2O2釋放藥物的能力,，將不同水平的H2O2與探針BHC-Lut共孵育,，在不同時(shí)間時(shí)評(píng)估藥物的累積釋放百分比。如圖1E所示,，與100μM H2O2共孵育的探針BHC-Lut將木犀草素快速釋放,，而未經(jīng)H2O2處理的探針釋放木犀草素的速度非常慢。接下來(lái)進(jìn)一步研究探針BHC-Lut對(duì)H2O2的響應(yīng)選擇性,，將探針BHC-Lut與不同的生物相關(guān)物質(zhì)共孵育25min,，檢測(cè)在930nm處熒光強(qiáng)度的比率。如圖1F所示,，與H2O2共孵育的探針BHC-Lut顯示出明顯的熒光增強(qiáng),，相反與其他生物相關(guān)物質(zhì)共孵育的探針BHC-Lut只有微小的熒光強(qiáng)度變化，表明探針BHC-Lut具有良好的H2O2響應(yīng)選擇性,。

圖2. A）對(duì)照組（健康小鼠）和模型組（小鼠分別腹腔注射DEN劑量為50mg kg-1,、100mg kg-1 、200mg kg-1）在靜脈注射探針BHC-Lut（2.25 mg kg-1）后不同時(shí)間點(diǎn)時(shí)（0,、15,、25、35,、45,、60 min）的NIR-II熒光成像。對(duì)仰臥位的小鼠進(jìn)行成像,。綠色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI,。激發(fā)光（808nm, 60mW cm-2）。在鹵素光照射下拍攝明場(chǎng)圖像,；B）圖2A中ROI的平均NIR-II熒光強(qiáng)度,；C）模型組和對(duì)照組小鼠10天內(nèi)的相對(duì)體重（n=5）

為了研究探針BHC-Lut在內(nèi)源性H2O2導(dǎo)致的急性肝損傷中的檢測(cè)和成像，首先通過(guò)腹腔注射DEN,，建立DEN導(dǎo)致小鼠肝損傷的模型,，通過(guò)注射不同DEN的劑量建造不同程度的肝損傷。通過(guò)H&E染色分析發(fā)現(xiàn),，與對(duì)照組相比,，DEN高劑量組小鼠肝細(xì)胞空泡腫脹加重，并且隨著DEN劑量的增加肝損傷加重,。接著通過(guò)熒光成像進(jìn)一步研究,，如圖2A和2B所示，在靜脈注射BHC-Lut25min后,，小鼠肝區(qū)域的熒光信號(hào)清晰可見,，并且隨著時(shí)間增長(zhǎng)和DEN劑量增多熒光強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)。此外,，隨著DEN的劑量增多,，小鼠相對(duì)體重逐漸下降，進(jìn)一步表明了DEN的毒性（圖2C）,。

圖3. A）探針BHC-Lut（2.25mg kg-1）靜脈注射0和60min后模型組和對(duì)照組的MOST橫斷面成像,。脊髓標(biāo)記為“1"。白色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI,；B）3A中ROI區(qū)域的平均MOST強(qiáng)度（n=5）,；C）模型組和對(duì)照組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的水平（n=5）；D）探針BHC-Lut（2.25mg kg-1）靜脈注射0和60min后模型組和對(duì)照組的3D MOST成像,。脊髓標(biāo)記為“1",。白色虛線表示肝臟區(qū)域

接下來(lái)通過(guò)MOST成像進(jìn)一步研究探針BHC-Lut在內(nèi)源性H2O2導(dǎo)致的急性肝損傷中的檢測(cè)和成像，如圖3A和3B所示,，與對(duì)照組相比,，模型組小鼠在靜脈注射探針BHC-Lut后,，隨著時(shí)間增長(zhǎng)和DEN劑量的增多，MOST強(qiáng)度逐漸增強(qiáng),；注射后60min后,，肝臟區(qū)域出現(xiàn)明顯的MSOT信號(hào)。圖3C所示的是小鼠ALT的水平,，注射高DEN劑量的小鼠ALT水平顯著升高,，并且明顯高于對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了高DEN劑量會(huì)導(dǎo)致更嚴(yán)重的肝損傷,。此外,，如圖3D所示，靜脈注射探針BHC-Lut 60min后,，高DEN劑量組小鼠肝臟MSOT信號(hào)明顯高于對(duì)照組,。MSOT成像結(jié)果與NIR-II成像結(jié)果一致，證明了急性肝損傷的程度隨DEN劑量的增加而加重,。

圖4. A）在3次或6次注射治療后,，對(duì)四組進(jìn)行NIR-II熒光成像。對(duì)照組：健康的小鼠,，生理鹽水組：模型小鼠用生理鹽水治療,，木犀草素組：模型小鼠用木犀草素（1.02mg kg-1）治療，探針組：模型小鼠用探針BHC-Lut（4.5mg kg-1,，相當(dāng)于1.02mg kg-1的木犀草素）治療,。對(duì)仰臥位的小鼠進(jìn)行成像。激發(fā)波長(zhǎng)為808nm,。綠色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI,。在鹵素光照射下拍攝明場(chǎng)圖像；B）在3次或6次注射治療后,，對(duì)四組進(jìn)行MSOT橫斷面成像,。脊髓以“1"表示。對(duì)俯臥位的小鼠進(jìn)行成像,。白色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI,；C）圖4A中第3天或第6天中ROI區(qū)域的平均NIR-II熒光強(qiáng)度（n=5）；D）圖4B中第3天或第6天覆蓋肝臟區(qū)域的ROI的平均MOST強(qiáng)度（n=5）,；E）第3天和第6天小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平（n=5）

為了探討探針BHC-Lut對(duì)DEN所致小鼠急性肝損傷的治療作用,，通過(guò)腹腔注射將DEN （100mg kg-1）注入小鼠體內(nèi)，建立小鼠急性肝損傷模型,。如圖4A和4C所示,，無(wú)論是第3天還是第6天，探針組小鼠的肝臟區(qū)域的NIR-II熒光信號(hào)都明顯弱于生理鹽水組和木犀草素組,，接近于對(duì)照組的NIR-II熒光信號(hào),，表明探針BHC-Lut對(duì)于肝損傷具有良好的治療效果,。之后進(jìn)行H&E染色的組織學(xué)分析和小鼠體重的研究，進(jìn)一步驗(yàn)證了探針BHC-Lut對(duì)于肝損傷的治療作用,。

如圖4B和4D所示,，相比于生理鹽水組和木犀草素組，探針組小鼠的肝臟區(qū)域的光聲信號(hào)明顯較弱,，與對(duì)照組的光聲信號(hào)相近。MOST成像數(shù)據(jù)與NIR-II成像數(shù)據(jù)一致,，表明了探針BHC-Lut對(duì)于肝損傷具有良好的治療效果,。此外，探針組小鼠的ALT水平明顯低于生理鹽水組和木犀草素組,，與對(duì)照組ALT水平接近（圖4E）,，進(jìn)一步驗(yàn)證了探針BHC-Lut的治療能力。

總結(jié)：本文開發(fā)一種可激活的探針,，通過(guò)對(duì)原位肝臟生物標(biāo)記物H2O2的響應(yīng),，實(shí)現(xiàn)對(duì)食物添加劑引起的肝損傷進(jìn)行NIR-II成像和MOST成像，同時(shí)釋放治療藥物木犀草素,。探針BHC-Lut不僅可以用于小鼠肝損傷的檢測(cè),，而且可以提供對(duì)肝損傷的治療。提供了一種治療策略：通過(guò)響應(yīng)生物標(biāo)記物釋放生色團(tuán)和藥物,，實(shí)現(xiàn)對(duì)疾病的檢測(cè)和治療,。

參考文獻(xiàn)

doi.org/10.1016/j.aca.2022.339831

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