本文要點：食品添加劑在食品生產(chǎn)中是常見的,，在食品加工或準備過程中亞硝酸鹽（防腐劑）和胺會反應(yīng)生成亞硝胺，亞硝胺是一種劇毒物質(zhì)已知會引起肝毒性甚至癌癥,。準確檢測亞硝胺導(dǎo)致的急性肝損傷有助于制定較好治療方案,，避免病情進一步惡化。本文開發(fā)了一種可激活的探針BHC-LUT,，在原位肝臟生物標志物H2O2的觸發(fā)下,，可以釋放藥物木犀草素進行治療，同時形成生色團（BHC-OH）用于NIR-II熒光成像和多光譜光聲層析（MOST）成像,。近紅外二區(qū)活體成像系統(tǒng) - MARS

以苯并吲哚七甲基菁為生色團骨架,，在苯并吲哚基團上引入三甘醇，提高探針的水溶性和生物相容性,；通過硼酸鍵將木犀草素偶聯(lián)到發(fā)色團上,，其中硼酸既是H2O2的響應(yīng)基團，又是熒光的淬滅劑,。當探針BHC-Lut通過靜脈注射到DEN誘導(dǎo)肝損傷的小鼠體內(nèi),，此時小鼠肝臟中存在H2O2，探針BHC-Lut中硼酸識別到H2O2,，釋放出藥物木犀草素進行治療,，同時釋放出熒光團BHC-OH用于NIR-II熒光成像和MOST成像。

圖1. A）探針BHC-Lut（5μM）與H2O2（0,、5,、10、20、30,、45,、60和80μM）反應(yīng)25min前后的吸收光譜。插圖：830 nm處的吸光度與H2O2濃度的函數(shù)關(guān)系,；B）探針BHC-Lut（20μM）與H2O2（0,、50、100,、120,、200和300μM）反應(yīng)25min前后的熒光光譜。插圖：930nm處的熒光強度與H2O2濃度的函數(shù)關(guān)系,；C）探針BHC-Lut（20μM）在不同時間（0,、1、3,、6,、10、15,、20和25min）與H2O2（300μM）反應(yīng)后的熒光光譜,。插圖：930 nm處的熒光強度隨時間變化；D）探針BHC-Lut（20μM）的相對OA強度與H2O2水平(0,、20,、40、80,、160,、320μM)之間的關(guān)系。插圖：探針BHC-Lut與不同水平的H2O2反應(yīng)后的光聲圖像,；E）探針BHC-Lut（10μM）中與不同劑量的H2O2作用不同時間（0,，5，10,，20,，40，60,，80min）前后木犀草素的累積釋放百分比,；F）探針BHC-Lut（20μM）在不同生物相關(guān)物質(zhì)中熒光強度（930 nm）的比率。a.空白,，b.H2O2（300μM）,，c.谷胱甘肽（1mM），d.半胱氨酸（1mM）,，e. L-異亮氨酸（1mM）,，f.谷氨酸（1mM），g.酪氨酸（1mM）,，h.丙氨酸（1mM）,，i.葡萄糖（1mM），j.精氨酸（1mM）,，k.NaNO2（1mM）,，l.NaClO（300μM），m. Na+（1mM）,，n. K+（1mM）,，o. Ca2+（1mM），p. Mg2+（1mM）,。激發(fā)波長：808 nm

首先利用光譜測量研究探針BHC-Lut對于H2O2的光學性質(zhì),。如圖1A和1B所示，在沒有H2O2存在時,，探針BHC-Lut的熒光強度是很低的,；隨著H2O2的水平增加，探針BHC-Lut的吸光度和熒光強度逐漸增強,。另外,，隨著探針BHC-Lut與H2O2反應(yīng)時間增長，熒光強度也隨之增強（圖1C）,。如圖1D所示,，探針BHC-Lut與不同濃度的H2O2反應(yīng)，隨著H2O2水平增高,，探針BHC-Lut的光聲信號隨著增強,。結(jié)果表明探針BHC-Lut可以響應(yīng)H2O2，并且可以產(chǎn)生用于檢測H2O2的熒光成像和光聲信號,。

為了評估通過響應(yīng)H2O2釋放藥物的能力,，將不同水平的H2O2與探針BHC-Lut共孵育，在不同時間時評估藥物的累積釋放百分比,。如圖1E所示,，與100μM H2O2共孵育的探針BHC-Lut將木犀草素快速釋放，而未經(jīng)H2O2處理的探針釋放木犀草素的速度非常慢,。接下來進一步研究探針BHC-Lut對H2O2的響應(yīng)選擇性,，將探針BHC-Lut與不同的生物相關(guān)物質(zhì)共孵育25min，檢測在930nm處熒光強度的比率,。如圖1F所示,，與H2O2共孵育的探針BHC-Lut顯示出明顯的熒光增強，相反與其他生物相關(guān)物質(zhì)共孵育的探針BHC-Lut只有微小的熒光強度變化,，表明探針BHC-Lut具有良好的H2O2響應(yīng)選擇性,。

圖2. A）對照組（健康小鼠）和模型組（小鼠分別腹腔注射DEN劑量為50mg kg-1,、100mg kg-1 、200mg kg-1）在靜脈注射探針BHC-Lut（2.25 mg kg-1）后不同時間點時（0,、15,、25、35,、45,、60 min）的NIR-II熒光成像。對仰臥位的小鼠進行成像,。綠色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI,。激發(fā)光（808nm, 60mW cm-2）。在鹵素光照射下拍攝明場圖像,；B）圖2A中ROI的平均NIR-II熒光強度,；C）模型組和對照組小鼠10天內(nèi)的相對體重（n=5）

為了研究探針BHC-Lut在內(nèi)源性H2O2導(dǎo)致的急性肝損傷中的檢測和成像，首先通過腹腔注射DEN,，建立DEN導(dǎo)致小鼠肝損傷的模型,，通過注射不同DEN的劑量建造不同程度的肝損傷。通過H&E染色分析發(fā)現(xiàn),，與對照組相比,，DEN高劑量組小鼠肝細胞空泡腫脹加重，并且隨著DEN劑量的增加肝損傷加重,。接著通過熒光成像進一步研究,，如圖2A和2B所示，在靜脈注射BHC-Lut25min后,，小鼠肝區(qū)域的熒光信號清晰可見,，并且隨著時間增長和DEN劑量增多熒光強度逐漸增強。此外,，隨著DEN的劑量增多,，小鼠相對體重逐漸下降，進一步表明了DEN的毒性（圖2C）,。

圖3. A）探針BHC-Lut（2.25mg kg-1）靜脈注射0和60min后模型組和對照組的MOST橫斷面成像,。脊髓標記為“1"。白色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI,；B）3A中ROI區(qū)域的平均MOST強度（n=5）,；C）模型組和對照組小鼠血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）的水平（n=5）；D）探針BHC-Lut（2.25mg kg-1）靜脈注射0和60min后模型組和對照組的3D MOST成像,。脊髓標記為“1",。白色虛線表示肝臟區(qū)域

接下來通過MOST成像進一步研究探針BHC-Lut在內(nèi)源性H2O2導(dǎo)致的急性肝損傷中的檢測和成像，如圖3A和3B所示,，與對照組相比,，模型組小鼠在靜脈注射探針BHC-Lut后,，隨著時間增長和DEN劑量的增多，MOST強度逐漸增強,；注射后60min后,，肝臟區(qū)域出現(xiàn)明顯的MSOT信號。圖3C所示的是小鼠ALT的水平,，注射高DEN劑量的小鼠ALT水平顯著升高,，并且明顯高于對照組,，進一步證實了高DEN劑量會導(dǎo)致更嚴重的肝損傷,。此外，如圖3D所示,，靜脈注射探針BHC-Lut 60min后,，高DEN劑量組小鼠肝臟MSOT信號明顯高于對照組。MSOT成像結(jié)果與NIR-II成像結(jié)果一致,，證明了急性肝損傷的程度隨DEN劑量的增加而加重,。

圖4. A）在3次或6次注射治療后，對四組進行NIR-II熒光成像,。對照組：健康的小鼠,，生理鹽水組：模型小鼠用生理鹽水治療，木犀草素組：模型小鼠用木犀草素（1.02mg kg-1）治療,，探針組：模型小鼠用探針BHC-Lut（4.5mg kg-1,，相當于1.02mg kg-1的木犀草素）治療。對仰臥位的小鼠進行成像,。激發(fā)波長為808nm,。綠色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI。在鹵素光照射下拍攝明場圖像,；B）在3次或6次注射治療后,，對四組進行MSOT橫斷面成像。脊髓以“1"表示,。對俯臥位的小鼠進行成像,。白色虛線表示肝臟區(qū)域的ROI；C）圖4A中第3天或第6天中ROI區(qū)域的平均NIR-II熒光強度（n=5）,；D）圖4B中第3天或第6天覆蓋肝臟區(qū)域的ROI的平均MOST強度（n=5）,；E）第3天和第6天小鼠的血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶水平（n=5）

為了探討探針BHC-Lut對DEN所致小鼠急性肝損傷的治療作用，通過腹腔注射將DEN （100mg kg-1）注入小鼠體內(nèi),，建立小鼠急性肝損傷模型,。如圖4A和4C所示，無論是第3天還是第6天,，探針組小鼠的肝臟區(qū)域的NIR-II熒光信號都明顯弱于生理鹽水組和木犀草素組,，接近于對照組的NIR-II熒光信號,，表明探針BHC-Lut對于肝損傷具有良好的治療效果。之后進行H&E染色的組織學分析和小鼠體重的研究,，進一步驗證了探針BHC-Lut對于肝損傷的治療作用,。

如圖4B和4D所示，相比于生理鹽水組和木犀草素組,，探針組小鼠的肝臟區(qū)域的光聲信號明顯較弱,，與對照組的光聲信號相近。MOST成像數(shù)據(jù)與NIR-II成像數(shù)據(jù)一致,，表明了探針BHC-Lut對于肝損傷具有良好的治療效果,。此外，探針組小鼠的ALT水平明顯低于生理鹽水組和木犀草素組,，與對照組ALT水平接近（圖4E）,，進一步驗證了探針BHC-Lut的治療能力。

總結(jié)：本文開發(fā)一種可激活的探針,，通過對原位肝臟生物標記物H2O2的響應(yīng),，實現(xiàn)對食物添加劑引起的肝損傷進行NIR-II成像和MOST成像，同時釋放治療藥物木犀草素,。探針BHC-Lut不僅可以用于小鼠肝損傷的檢測,，而且可以提供對肝損傷的治療。提供了一種治療策略：通過響應(yīng)生物標記物釋放生色團和藥物,，實現(xiàn)對疾病的檢測和治療,。

參考文獻

doi.org/10.1016/j.aca.2022.339831

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近紅外二區(qū)小動物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

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