本文要點(diǎn)：原發(fā)性肝腫瘤的準(zhǔn)確診斷和有效治療具有重要意義,，光學(xué)成像已廣泛應(yīng)用于臨床影像引導(dǎo)下的肝腫瘤手術(shù),。第二近紅外窗口(NIR-II)發(fā)射的AIEgen光敏劑以其更高分辨率的生物成像和更深的穿透性而備受關(guān)注。NIR-II聚集誘導(dǎo)發(fā)光物質(zhì)(AIEgen)光敏劑在影像引導(dǎo)手術(shù)/光療中具有更好的光療效果和準(zhǔn)確性,。在此,，本文提出了一種NIR-II AIEgen光熱消融點(diǎn)，用于NIR-II影像引導(dǎo)下的原位肝腫瘤切除手術(shù)和光療,。與吲哚青綠(ICG)相比,，AIEgen斑點(diǎn)在1250 nm處表現(xiàn)出明亮而銳利的近紅外(NIR-II)發(fā)射，并延伸到1600 nm處,，具有很高的光穩(wěn)定性,。此外，AIEgen DOTS有效地產(chǎn)生了用于光動力治療的活性氧(ROS),。對體內(nèi)和體外原位肝腫瘤的研究表明,，AIEgen DOTS既可以用于早期腫瘤的影像引導(dǎo)腫瘤手術(shù)，也可以用于“降級"縮小腫瘤大小的意圖,。此外，該治療策略*抑制了原位腫瘤,，無復(fù)發(fā),，副作用少。

方案1 NIR-II發(fā)射型AIEgen光敏劑PTZ-TQ的示意圖，該光敏劑能夠?qū)崿F(xiàn)超靈敏的成像引導(dǎo)手術(shù)和光療以*抑制原位肝腫瘤

圖1 a)PTZ-TQ分子的合成路線b)PTZ-TQ在四氫呋喃(THF)和水體積分?jǐn)?shù)(FW)為95%的THF/H2O中的b)吸收光譜c)PTZ-TQ在THF/H2O(FW,，0%~95%)中的發(fā)射d)發(fā)射強(qiáng)度比(I/I0),根據(jù)PTZ-TQ在不同F(xiàn)W下的(c)計(jì)算e)PTZ-TQ在四氫呋喃/水(FW,，95%)和純四氫呋喃中的近紅外-II熒光圖像f)經(jīng)1%脂質(zhì)體溶液檢測PTZ-TQ和ICG的信號強(qiáng)度g)計(jì)算了PTZ-TQ的HOMO和LOMO

圖2 a) PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的TEM圖像b)水中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的尺寸分布c)PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在水溶液中的UV-Vis-NIR吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜d)PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在間歇808 nm激光(0.25W/cm2)照射60min下在PBS、FBS和DMEM中的光穩(wěn)定性.e)吸光度和f)在808 nm激光(0.25W/cm2)連續(xù)照射30min下的NIR-II熒光發(fā)射g)PTZ-TQ-AIE在水中的 NIR-II熒光圖像h)PTZ-TQ-AIE和ICG通過不同濃度的1%磷脂溶液的信號強(qiáng)度

首先,，采用納米沉淀法制備了PTZ-TQ-AIE點(diǎn),。透射電子顯微鏡(TEM)測得PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的尺寸約為80 nm,，動態(tài)光散射(DLS)分析測得其尺寸約為255 nm(圖2A,，b),，水溶液中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的UV-VIS-NIR吸收光譜和NIR-II熒光發(fā)射光譜表明,，675 nm處的吸收峰擴(kuò)展到900 nm,，1150 nm處的熒光發(fā)射峰和發(fā)射尾部的熒光發(fā)射峰擴(kuò)展到接近1600 nm(圖2C),。在808 nm激光激發(fā)下，水溶液中PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的量子產(chǎn)額(QY)為0.3%,。PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在PBS,、FBS和DMEM介質(zhì)中表現(xiàn)出優(yōu)異的光穩(wěn)定性。當(dāng)用功率密度為0.25W/cm~2的808 nm激光連續(xù)照射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)30min時,，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的吸收和發(fā)射光譜沒有明顯變化(圖2D，e),。此外,，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在磷酸鹽緩沖液(PBS)、培養(yǎng)基(DMEM)和胎牛血清(FBS)中的發(fā)光強(qiáng)度在相同密度下連續(xù)照射60min后沒有變化(圖2F),。PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的光穩(wěn)定性遠(yuǎn)好于商品化的ICG染料,，表明PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)具有良好的體內(nèi)長期熒光成像潛力。

接著,，用不同的濾光片測量了NIR-IIb的熒光強(qiáng)度,。PTZ-TQ-AIE點(diǎn)顯示出比PTZ-TQ(FW=95%)(圖2G)更好的NIR-IIa(1000-1300nm)和NIRIIb(1400-1700 nm)熒光信號。此外，在1050 nm的熒光穿透深度表明,，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在8毫米的深度可以分辨出更銳利的毛細(xì)管邊緣,；在相同的條件下，ICG只在4毫米的深度顯示出類似的分辨率(圖2H),。

圖3 電子順磁共振(EPR)譜檢測1O2的產(chǎn)生a)記錄不同濃度(0~30μg/mL)的Ptz-TQ-AIE點(diǎn)的1O2探針的b)熒光光譜(實(shí)線：激光照射,，虛線：不照射),不同時間照射下，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)氧探針的c)熒光強(qiáng)度d)DCFH-DA誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞內(nèi)ROS產(chǎn)生e)鈣黃綠素-AM(活細(xì)胞的綠色熒光)和PI(死亡細(xì)胞的紅色熒光)共染色的HepG2細(xì)胞的E熒光圖像f)PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)與808 nm近紅外激光(0.25W/cm2)孵育24小時后對LO2細(xì)胞,、HepG2細(xì)胞的體外細(xì)胞毒作用

接下來,，用二氯二氫化熒光素二乙酸酯評價了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)的活性氧生成能力以DCFH-DA)作為指標(biāo)。在PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(808 nm,，0.25W/cm2)存在下,，DCFH-DA的熒光隨照射時間的延長而急劇增加。為了進(jìn)一步驗(yàn)證,，電子順磁共振(EPR)被用來驗(yàn)證ROS的產(chǎn)生,。在5 mm的活性氧指示劑TEMPONE與PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在溶液中孵育后，然后照射5分鐘進(jìn)行EPR測量,，當(dāng)添加β-胡蘿卜素時EPR信號減少(圖3A),，證明了1O2的有效產(chǎn)生。為了了解生成的物種,，shou ci 使用單線態(tài)氧傳感器綠(SOSG)來評估1O2的生成,。在PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(808 nm，0.25W/cm2)照射下,，SOSG的熒光隨照射時間的增加而急劇增加,，證實(shí)1O2是主要的活性氧(圖3B，c),。由于PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)具有優(yōu)良的近紅外發(fā)射和活性氧產(chǎn)生能力,，因此研究了該斑點(diǎn)在癌癥診斷和治療中的應(yīng)用潛力。如圖3D所示,，在輻射下,，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)加激光組顯示DCFH-DA的亮綠色熒光，表明ROS的產(chǎn)生被有效地誘導(dǎo),，并通過流式細(xì)胞儀對細(xì)胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生進(jìn)行了定量,。ROS的有效產(chǎn)生導(dǎo)致細(xì)胞死亡(圖3e)。然而,，只有輻照或PTZ-TQ-AIE點(diǎn)顯示出可以忽略的紅色熒光,，這表明PTZ-TQ-AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性,，單獨(dú)激光照射的危害有限(圖3e)。以正常肝細(xì)胞為對照,，體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)表明,，在100μg/mL濃度下，PTZTQ-AIE dots對正常細(xì)胞和癌細(xì)胞幾乎沒有明顯的毒性作用,。3F),。此外，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)和輻射導(dǎo)致細(xì)胞存活率顯著降低,，證明了體外光動力療法(PDT)療效,，且PTZ-TQAIE點(diǎn)劑本身副作用較小。

圖4 a)在尾靜脈注射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)后120s,、300s和15min的活體長期后肢血管NIR-II成像b)根據(jù)(a)(120秒)中沿黃線測量的橫截面強(qiáng)度剖面測量的血管半高寬寬度,，峰值擬合為高斯函數(shù)c)尾靜脈注射PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)后不同時間點(diǎn)，取原位肝癌大鼠不同時間點(diǎn)的活體長期近紅外熒光圖像,，白色圓圈表示腫瘤,。d）肝臟和腫瘤的圖像e)NIR-II光學(xué)成像引導(dǎo)腫瘤切除圖示f)NIR-II和生物發(fā)光成像在手術(shù)中的應(yīng)用g)荷瘤小鼠的相對腫瘤生長曲線及相應(yīng)的熒光強(qiáng)度h)肝解剖治療后的照片

然后,，為了進(jìn)一步研究PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的近紅外成像和光動力學(xué)治療能力,，shou ci 對PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的體內(nèi)生物相容性和生物分布進(jìn)行了評價。給健康BALB/c小鼠靜脈注射PTZ-TQ-AIE點(diǎn)(2 00μL,，5 0 0μg/mL)后,，采集血樣，進(jìn)行分析,，主要血細(xì)胞計(jì)數(shù)無明顯變化,，提示PTZ-TQ-AIE點(diǎn)具有良好的生物相容性。PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)在肝臟和脾臟中有較高的蓄積,，表明PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的清除途徑是通過肝膽系統(tǒng),。與ICG相比，PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的血液循環(huán)半衰期相對較長,，為61±21分鐘,，然后對PTZ-TQ-AIE斑點(diǎn)的血管成像性能進(jìn)行了研究。注射后2分鐘,、5分鐘和15分鐘通過NIR-II成像可以清楚地顯示血管系統(tǒng)(圖4A),。此外，后肢血管的分辨率(711.8μm)是通過測量高斯擬合的半高寬(FWHM)(圖4B)達(dá)到的,，這將足以用于外科手術(shù),。

為了評價深部組織的成像和治療，建立了裸鼠原位肝腫瘤模型,。將螢火蟲熒光素酶基因轉(zhuǎn)染人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞,，經(jīng)剖腹接種于肝右葉。在確認(rèn)成功建立原位肝腫瘤后，將PTZTQ-AIE斑點(diǎn)(200μL,，500μg/mL)靜脈注射到荷瘤小鼠體內(nèi),。在808 nm激光的激發(fā)下，正常肝臟和腫瘤部位的NIR-II熒光被連續(xù)記錄,。在注射后2h,，離體結(jié)果顯示腫瘤部位的NIR-II熒光信號低于正常肝組織；腫瘤中較低的NIR-II信號清楚地識別了腫瘤與正常肝器官之間的邊界,，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在注射后48小時達(dá)到 zui da (圖4C,，注射后48h，腫瘤區(qū)域可見明亮銳利的NIR-II信號,。NIR-II熒光成像的信噪比(SNR)隨時間逐漸增加,，48h達(dá)到 zui da 值。為了進(jìn)一步確定腫瘤的位置,，在注射后96h拍攝了整個肝組織（圖4D),；定位與在活體NIR-II圖像上觀察到的位置一致(圖4C中的圓圈)。這些結(jié)果表明,，在注射后2h通過負(fù)強(qiáng)化或在注射后48h通過正強(qiáng)化可以清楚地識別腫瘤與正常肝器官之間的邊界,。因此，PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在注射后2h和48h均可用于影像引導(dǎo)手術(shù),，可根據(jù)腫瘤大小提供個性化的治療選擇,。

鑒于PTZ-TQ-AIE點(diǎn)是較強(qiáng)的活性氧發(fā)生器，研究了PTZ-TQ-AIE點(diǎn)在光動力治療中應(yīng)用的可行性,，以縮小腫瘤的體積,，以便進(jìn)一步手術(shù)切除，防止腫瘤的復(fù)發(fā),。因此,，采用了不同的治療方法：對于較大的腫瘤，*行PDT治療以縮小腫瘤體積,，然后進(jìn)行手術(shù)以 zui da 限度地減少治療過程中對肝臟的損傷(稱為PDT+手術(shù)),；對于較小的腫瘤，*行手術(shù),，然后對殘留的腫瘤進(jìn)行PDT治療(稱為手術(shù)+PDT),。治療過程由BLI監(jiān)測，用總BLI強(qiáng)度和相對腫瘤生長來總結(jié)不同治療方法下的腫瘤生長情況,。如圖4G所示,，對照組(PBS、PBS+激光和PTZ-TQ-AIE點(diǎn))的BLI信號迅速增加,，表明腫瘤生長速度較快,。單一的治療過程(PDT或手術(shù))導(dǎo)致BLI信號顯著降低,，證明了單一影像引導(dǎo)手術(shù)或PDT在腫瘤治療中的有效性。然而,，兩個單一治療過程中的腫瘤隨著時間的推移而復(fù)發(fā)(圖4G中的綠色和粉紅色曲線),。早期治療取得了與單一治療過程相似的療效，但在觀察期內(nèi)無腫瘤復(fù)發(fā)(圖4G中紫色和深藍(lán)色曲線),。

最后模擬了一個不適合手術(shù)的大型肝癌模型(圖4G中的紫色曲線),。在臨床環(huán)境中，“降級"意圖包括預(yù)處理以減小活躍腫瘤的大小或數(shù)量,。首先使用PDT來減小尺寸,，PDT治療后，BLI信號在治療后第7天急劇下降,，然后進(jìn)行手術(shù)以實(shí)現(xiàn)幾乎*的腫瘤抑制(圖中紫色曲線,。4G)。體內(nèi)肝臟的磁共振成像(MRI)和體外照片證實(shí),，多種治療組幾乎沒有腫瘤結(jié)節(jié)(圖4h）,。

參考文獻(xiàn)

JiaR, Xu H, Wang C, Su L, Jing J, Xu S, Zhou Y, Sun W, Song J, Chen X, Chen H.NIR-II emissive AIEgen photosensitizers enable ultrasensitive imaging-guidedsurgery and phototherapy to fully inhibit orthotopic hepatic tumors. JNanobiotechnology.

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