本文要點(diǎn)：各種方酸染料已被開發(fā)用于生物成像。然而,，由于缺乏一種簡(jiǎn)單,、通用的設(shè)計(jì)策略，在第二窗口(近紅外Ⅱ 1000?1700 nm)發(fā)射的方酸染料的研究報(bào)道很少,，在這篇文章中,，探索了分子工程策略來(lái)開發(fā)具有NIR-II發(fā)射的方酸染料。首先,，以1,，8-萘內(nèi)酰亞胺為給體，方酸為受體合成了NIR-I染料SQ2,引入丙二腈作為強(qiáng)吸電子基團(tuán)使熒光發(fā)射紅移到NIR-II窗口,，合成了SQ1,。為了將NIR-II型熒光載體SQ1轉(zhuǎn)化為有效的治療藥物，構(gòu)建了以纖維連接蛋白為靶點(diǎn)的SQ1納米探針,，在血管造影和腫瘤成像(包括深部組織中的肺轉(zhuǎn)移灶)中顯示出優(yōu)異的NIR-II成像性能,。此外，SQ1納米探針可用于腫瘤的光聲成像和光熱消融,。本研究表明,，采用供體?受體工程策略開發(fā)近紅外-Ⅱ類方酸染料是可行和有效的。

方酸染料SQ1用于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的NIR-II/PA雙峰成像和光熱消融的分子工程和納米功能化研究方案1.

首先,，SQ1納米探針的構(gòu)建與表征如圖1,，具有受體工程的SQ1在930和970 nm處表現(xiàn)出明顯的紅移(圖1b，c),。因此,，SQ1的熒光發(fā)射延伸到了近紅外-Ⅱ區(qū)，表明D?A?D工程成功地使SQ1成為近紅外-Ⅱ發(fā)射體。

圖1：(A)SQ1和SQ2有機(jī)合成示意圖,，(B)四氫呋喃(THF)中SQ1和SQ2的吸光度和發(fā)射率,，(d，e)密度泛函理論(DFT)計(jì)算(D)SQ1和(E)SQ2的HOMO和LUMO

為了將近紅外熒光團(tuán)SQ1轉(zhuǎn)化為有效的熱敏劑,，在超聲作用下,，將溶解的SQ1與DSPE-PEG2000和DSPE-PEG2000-MAL一起在水中納米沉淀，制備SQ1@DSPE,，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的活性靶向纖維連接蛋白的多肽CREKA通過(guò)半胱氨酸(Cys)與SQ1@DSPE的反應(yīng)被共價(jià)連接到SQ1@DSPE上就獲得SQ1納米探針,。

圖2：SQ1納米探針的尺寸分析和光物理特性 (A)SQ1納米探針的DLS和TEM。(B)Sq1納米探針在PbS中的吸收光譜和熒光光譜,，(c,，d)近紅外-II型熒光圖像和(E)偽彩色圖像和(F)SQ1納米探針和SQ2納米探針，在915 nm光照下的定量曲線,，(g,，h)含有SQ1、SQ2納米探針(1 mg/mL)試管在近紅外激光(915 nm,，100 mW/cm2)照射下,，(G)在沒(méi)有和(H)覆蓋豬肉組織的情況下進(jìn)行NIR-II成像

如圖2a所示，透射電子顯微鏡(TEM)和動(dòng)態(tài)激光光散射(DLS)顯示SQ1納米探針的長(zhǎng)度分別約為20 nm和42 nm,。與SQ1相比,，SQ1納米探針的吸收峰在930 nm處略有紅移至940 nm(圖2b)。與SQ1(0.13%)相比,，與DSPE-PEG2000結(jié)合形成納米粒子后,，SQ1納米探針的量子產(chǎn)率提高到1.7%。SQ1納米探針在940 nm處的強(qiáng)吸收也顯示了PA成像的潛力,。SQ1納米探針在980 nm處顯示熒光峰延伸到NIR-II區(qū)域,。SQ1型納米探針的熒光信號(hào)與納米探針濃度呈良好的線性相關(guān)(圖2c?f)。此外,，在含有SQ1和SQ2納米探針(1 mg/mL)的試管上覆蓋豬肉切片,，檢測(cè)組織滲透深度如圖2g，h所示,，SQ1納米探針在915 nm(100 mW/cm2)的照射下,，其明亮的NIR-II發(fā)射可以穿透覆蓋的豬肉切片(3 mm)。值得注意的是,，DSPE-PEG2000的包裹和腫瘤靶向多肽的修飾幾乎沒(méi)有改變SQ1的光學(xué)性質(zhì),，表明制備良好的SQ1納米探針適合于NIR-II成像。

圖3：(A)SQ1納米探針和SQ2納米探針的功率譜,(B)SQ1納米探針和SQ2納米探針在930 nm處的PA強(qiáng)度隨濃度的變化曲線,(C)SQ1納米探針和SQ2納米探針(0.0625,、0.125,、0.250.5、1.0mg/mL)在930nm處的PA圖像(D)SQ1、Q2納米探針(1 mg/mL)的光熱加熱圖像和(E)SQ1納米探針(0.125,，0.25,，0.5，1.0 mg/mL)在近紅外激光照射下的溫度曲線

接著,，還研究了不同濃度的SQ1納米探針的PA強(qiáng)度和圖像,。如圖3a所示，SQ1納米探針的PA光譜在930 nm處出現(xiàn)一個(gè)峰值,，這與吸收相一致,。根據(jù)圖3b，c中不同濃度的SQ1納米探針的PA圖像,，PA信號(hào)與SQ1納米探針的濃度(0.0625?1 mg/mL)呈線性正相關(guān),。因此，將NIR-II成像與PA成像相結(jié)合作為雙峰成像可以提高乳腺癌的成像準(zhǔn)確性,。受近紅外區(qū)高吸收強(qiáng)度的啟發(fā),，進(jìn)一步研究了SQ1納米探針的光熱性質(zhì),。如圖3D所示,，含有SQ1納米探針的試管溫度從29.3°C上升到70.5°C，而單獨(dú)含有PbS的試管在激光照射下溫度變化不大,，SQ2納米探針的溫度略有升高,，Q1納米探針的光熱轉(zhuǎn)換效率為25.6%。此外,，圖3E中的SQ1納米探針在915 nm激光(0.5W/cm2)照射下表現(xiàn)出濃度依賴性的溫度變化,，這表明SQ1納米探針可以用于腫瘤的光熱消融。

圖4：(a,，b)乳腺癌細(xì)胞蛋白免疫印跡,，(C)冰凍切片檢測(cè)細(xì)胞核(Dapi)和纖維連接蛋白(Alexa Fluor488標(biāo)記的抗纖維連接蛋白抗體)(比例尺，50μm),，(D)SQ1納米探針SQ1NP+L處理的乳腺癌細(xì)胞存活率(e,，f)用0.5 mg/mLSQ1納米探針(E)在黑暗中或(F)用0.5W/cm2的915 nm激光照射5min，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鈣調(diào)素-AM/碘化丙啶(PI)染色,，比例尺：100μm

接下來(lái),，為了研究纖連蛋白水平與乳腺癌腫瘤惡性程度之間的依賴性，通過(guò)高度惡性MDA-MB-231和低度惡性MCF-7細(xì)胞的western印跡測(cè)試?yán)w連蛋白,。如圖4a,，b所示，纖維連接蛋白的表達(dá)與乳腺癌的惡性程度呈正相關(guān),。因此,，通過(guò)纖維連接蛋白結(jié)合肽的修飾，SQ1納米探針可以用來(lái)靶向纖維連接蛋白，并根據(jù)乳腺癌腫瘤中纖維連接蛋白水平的差異來(lái)識(shí)別高危乳腺癌,。

為了生物相容性的考慮,，用CCK8檢測(cè)與SQ1納米探針?lè)跤腗DA-MB231細(xì)胞的存活率。SQ1納米探針顯示出較低的細(xì)胞毒性,，在與SQ1納米探針(0?512μg/mL)孵育24小時(shí)后,，80%以上的細(xì)胞仍然存活(圖4d)。因此,，SQ1納米探針是一種生物相容性顯像劑,。最終，超過(guò)80%的MDA-MB-231細(xì)胞被SQ1納米探針介導(dǎo)的光熱效應(yīng)殺死,。SQ1納米探針(0.5 mg/mL)和近紅外激光(0.5W/cm2)預(yù)處理的MDA-MB-231細(xì)胞幾乎全部顯示SQ1納米探針能有效地在體外光熱殺滅腫瘤細(xì)胞,。

圖5：SQ1納米探針的體內(nèi)成像特性，(A)靜脈注射SQ1納米探針10分鐘后,，對(duì)小鼠血管進(jìn)行近紅外成像(NIR-II),，(b，c)兩個(gè)區(qū)(ROI 1和ROI 2)放大的后肢NIR-II圖像,，(d,，e)ROI1和ROI2后肢紅線的熒光強(qiáng)度，(F)靜脈注射SQ1納米探針或SQ1@DSPE(對(duì)照)后0,、1,、2、6,、12和24小時(shí),，對(duì)陽(yáng)性的MDA-MB-231腫瘤進(jìn)行NIR-II顯像，(G)在NIR-II顯像后同時(shí)進(jìn)行腫瘤PA顯像,，比例尺是2mm

緊接著,，為了顯示近紅外-II成像在血管造影中的優(yōu)點(diǎn)，靜脈注射SQ1100?納米探針(100μL,，100μg)后,，用近紅外-II成像技術(shù)在1000mm1100 nm區(qū)域?qū)π∈笱苓M(jìn)行成像。NIR-II成像可以清楚地顯示第二個(gè)窗口中由于組織穿透增加而導(dǎo)致的皮膚下血管的分布(圖5a),。高倍率的NIR-II圖像可以清楚地顯示通過(guò)小鼠后肢動(dòng)脈的血液流動(dòng)(圖5b,，c)。提示NIR-II成像適用于血管造影(圖5d,，e),。這些結(jié)果表明，使用SQ1納米探針進(jìn)行血管造影的NIR-II成像是可行的,。

然后為了研究SQ1納米探針在小鼠體內(nèi)的近紅外成像能力,，分別對(duì)SQ1納米探針(100μL,，100μg)和非靶向SQ1@DSPE(100μL，100μg)進(jìn)行了研究,。如圖5f所示,，對(duì)于注射SQ1納米探針的小鼠，腫瘤內(nèi)的NIR-II成像信號(hào)顯著增強(qiáng),，注射SQ1@DSPE的小鼠腫瘤區(qū)域的熒光增強(qiáng)要弱得多,。

如NIR-II和PA成像所示，SQ1納米探針可以很好地累積到MDA-MB-231腫瘤中,，這主要是由于SQ1納米探針的有效主動(dòng)靶向,，而SQ1@DSPE通過(guò)被動(dòng)靶向攝入腫瘤。這些結(jié)果表明SQ1納米探針具有顯著的腫瘤靶向成像能力,。NIR-II/PA雙峰成像顯示靶向肽修飾的SQ1納米探針可以特異性結(jié)合纖連蛋白陽(yáng)性乳腺癌腫瘤,。這清楚地表明SQ1納米探針可以準(zhǔn)確地檢測(cè)和表達(dá)纖維連接蛋白陽(yáng)性乳腺癌的腫瘤病變。

圖6：使用SQ1納米探針對(duì)乳腺癌肺轉(zhuǎn)移小鼠的NIR-II成像,，(a,，b)靜脈注射SQ1納米探針后12h，(A)荷肺轉(zhuǎn)移瘤小鼠和(B)正常小鼠的NIR-II顯像,，(C)肺轉(zhuǎn)移小鼠和(D)正常小鼠全身NIR-II成像后的器官的體外NIR-II成像,，(E)肺轉(zhuǎn)移小鼠和(F)正常小鼠肺切片經(jīng)NIR-II成像后進(jìn)行(e，f)H&E組織化學(xué)分析,，比例尺為200μm

為了進(jìn)一步評(píng)估SQ1納米探針定位乳腺癌轉(zhuǎn)移性肺部病變的能力,。與正常小鼠相比,，攜帶肺轉(zhuǎn)移的小鼠的肺顯示增強(qiáng)的NIR-II熒光信號(hào),，表明SQ1納米探針可以選擇性地靶向乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移病灶（圖6a，b）且發(fā)現(xiàn)患有轉(zhuǎn)移性乳腺癌的小鼠的肺確實(shí)顯示出增加的信號(hào),，表明SQ1納米探針在肺轉(zhuǎn)移模型中的腫瘤特異性靶向能力（圖6c,，d）。如圖6e,，f所示,，攜帶轉(zhuǎn)移性腫瘤的小鼠肺中的多個(gè)病變顯示肺切片中存在浸潤(rùn)性腫瘤細(xì)胞，這進(jìn)一步證實(shí)SQ1納米探針能夠通過(guò)深度穿透來(lái)解決乳腺癌的肺轉(zhuǎn)移,。

圖7：使用SQ1納米探針(SQ1NP)對(duì)小鼠乳腺癌腫瘤進(jìn)行熱成像和PTT,，(A)注射PBS或SQ1NP加激光治療后腫瘤的熱成像。(B)光熱治療過(guò)程中腫瘤的溫度變化,，(C)腫瘤生長(zhǎng)曲線,；(D)治療期間小鼠生長(zhǎng)曲線，(E)PBS,、PBS+L,、SQ1NP,、SQ1NP+L治療后解剖腫瘤重量，標(biāo)尺為50μm,。

最后,，SQ1納米探針具有良好的腫瘤靶向性和良好的體外治療效果，進(jìn)一步促進(jìn)了對(duì)乳腺癌光熱治療的體內(nèi)評(píng)價(jià),。如圖7a,，b所示，注射SQ1納米探針的小鼠的腫瘤溫度從33.2°C迅速上升到59.1°C,，而PBS預(yù)處理的腫瘤溫度沒(méi)有明顯變化,。這些結(jié)果證實(shí)了SQ1納米探針在近紅外輻射下確實(shí)能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生顯著的熱變化。為驗(yàn)證其光熱治療效果,，對(duì)MDAMB-231乳腺癌荷瘤小鼠分別治療,，如圖7c所示，隨著時(shí)間的推移,，腫瘤體積的這些差異變得更加明顯,。此外，小鼠的體重變化與H&E組織化學(xué)分析顯示SQ1納米探針在近紅外激光照射下對(duì)乳腺癌腫瘤有明顯的光熱損傷作用,，具有較高的光熱治療效率,。

結(jié)論：通過(guò)合理的D-A-D工程，合成了一種發(fā)射延伸至第二窗口的方堿染料,。方酸染料SQ1通過(guò)簡(jiǎn)單的納米沉淀和靶向多肽修飾可以被包裹成SQ1納米探針,，顯示出NIR-II/PA雙峰成像能力和良好的光熱效應(yīng)。小鼠的NIR-II顯像表明,，SQ1納米探針適合于血管造影和腫瘤靶向顯像,，尤其是肺轉(zhuǎn)移灶。此外,，SQ1納米探針利用在近紅外輻射下優(yōu)異的光熱轉(zhuǎn)換能力,，在實(shí)體腫瘤的PA成像和PTT中都表現(xiàn)良好?？紤]到它在NIR-II區(qū)域的治療學(xué)的固有優(yōu)勢(shì),，基于方酸的治療納米探針將啟發(fā)其他轉(zhuǎn)移性乳腺癌的創(chuàng)新設(shè)計(jì)。

參考文獻(xiàn)

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近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng) - MARS 

NIR-II in vivo imaging system 

高靈敏度 - 采用Princeton Instruments深制冷相機(jī),，活體穿透深度高于15mm

高分辨率 - 定制高分辨大光圈紅外鏡頭,，空間分辨率優(yōu)于3um

熒光壽命 - 分辨率優(yōu)于 5us

高速采集 - 速度優(yōu)于1000fps （幀每秒）

多模態(tài)系統(tǒng) - 可擴(kuò)展X射線輻照、熒光壽命,、一區(qū)熒光成像,、原位成像光譜，CT等

顯微鏡 - 近紅外二區(qū)高分辨顯微系統(tǒng),，兼容成像型光譜儀

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 恒光智影

          上海恒光智影醫(yī)療科技有限公司,，專注于近紅外二區(qū)成像技術(shù),。致力于為生物醫(yī)學(xué)、臨床前和臨床應(yīng)用等相關(guān)領(lǐng)域的研究提供*的,、一體化的成像解決方案,。自主研發(fā)近紅外二區(qū)小動(dòng)物活體熒光成像系統(tǒng)-MARS。

          與基于可見(jiàn)光波長(zhǎng)的傳統(tǒng)成像技術(shù)相比,，我們的技術(shù)側(cè)重于X射線,、紫外、紅外,、短波紅外,、太赫茲范圍，可為腫瘤學(xué),、神經(jīng)學(xué),、心血管、藥代動(dòng)力學(xué)等一系列學(xué)科的科研人員提供清晰的成像效果,，助力科技研發(fā),。

          同時(shí)，恒光智影還具備探針研發(fā)能力,，我們已經(jīng)成功研發(fā)了超過(guò)15種探針,，這些探針將廣泛地應(yīng)用于眾多生物科技前沿領(lǐng)域的相關(guān)研究中。