本文要點(diǎn)：近紅外二區(qū),，短波紅外(SWIR，1000-1400納米) 區(qū)域的光散射和自熒光較低,，因此比傳統(tǒng)的可見光和近紅外熒光成像具有更高的對(duì)比度和靈敏度以及更深的穿透深度,，有望提供更高的信號(hào)與背景信號(hào)之比。

目前可用于生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用的生物相容性SWIR熒光探針數(shù)量非常有限,。在近紅外和SWIR熒光探針中,，吲哚青綠(ICG)是美國食品(FDA)批準(zhǔn)用于臨床的熒光染料，在830納米具有熒光極值,，也可以在SWIR區(qū)域發(fā)射,，然而，只有少數(shù)關(guān)于ICG的SWIR熒光分子成像用于可視化活體系統(tǒng)中的癌性腫瘤的報(bào)告,。在這篇論文中,，作者描述了基于ICG的SWIR熒光分子成像用于小鼠腫瘤的光學(xué)診斷。

作者使用了四種類型的單克隆抗體：抗HER2抗體(Herceptin),、抗EGFR抗體(Erbitux),、抗VEGFR-2抗體(Cyramza)、和抗PD-L1抗體(anti-PD-L1 ab)制備了四種ICG-抗體共軛物,，然后,，應(yīng)用基于ICG的SWIR熒光分子成像技術(shù)，對(duì)小鼠乳腺和皮膚腫瘤進(jìn)行了高靈敏度的光學(xué)檢測,，發(fā)現(xiàn)設(shè)計(jì)的SWIR分子成像探針能特異性地積累到乳腺和皮膚腫瘤,，并且它們的SWIR熒光圖像(> 1000納米)顯示出比在830納米拍攝的近紅外腫瘤圖像高1.5-2.0倍的對(duì)比度，由于其高對(duì)比度圖像,，盡管ICG的SWIR熒光發(fā)射遠(yuǎn)弱于其NIR熒光發(fā)射,，但I(xiàn)CG-抗體共軛物對(duì)于尺寸小于幾毫米的小腫瘤的SWIR光學(xué)檢測具有足夠的靈敏度，因此使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像能夠定量分析腫瘤大小的變化。此外,，作者的研究表明,，使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像可用于闡明體內(nèi)癌癥特異性膜蛋白HER2、EGFR,、VEGFR-2和PD-L1的表達(dá)水平,。而且由于ICG從腫瘤發(fā)出的熒光輻射在一個(gè)月內(nèi)保持穩(wěn)定，應(yīng)用 SWIR熒光成像能夠定量分析抗癌藥物Kadcyla治療腫瘤的大小變化,，進(jìn)而評(píng)估抗癌療效,。最終，作者認(rèn)為使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光分子成像有潛力用于醫(yī)學(xué)和臨床領(lǐng)域的癌性腫瘤的光學(xué)診斷,。

首先,，作為腫瘤靶向探針，作者分別用Herceptin,、Erbitux,、Cyramza和抗PD-L1抗體制備了四種ICG-抗體共軛物。（備注：鑒于細(xì)胞成像常規(guī)熒光顯微鏡在近紅外區(qū)(< 700 nm)的靈敏度較低,，作者使用發(fā)射可見光的Alexa488-抗體共軛物代替ICG-抗體共軛物）

圖1:  (a)染料的N-琥珀酰亞胺酯衍生物(Dye-NHS)與抗體結(jié)合的示意圖,。染料-NHS與抗體分子輕鏈和重鏈的氨基結(jié)合。(b)Alexa488和ICG結(jié)合Herceptin后的吸收光譜,。

接下來,，作者發(fā)現(xiàn)使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像可用于闡明體內(nèi)癌癥特異性膜蛋白HER2、EGFR,、VEGFR-2和PD-L1的表達(dá)水平,，對(duì)A431和KPL-4細(xì)胞進(jìn)行了western blotting analysis（蛋白質(zhì)印跡分析）(圖2a)。結(jié)果顯示,，KPL-4細(xì)胞過度表達(dá)所有的蛋白質(zhì)：EGFR,，HER2，VEGFR-2和PD-L1,，而A431細(xì)胞除了EGFR,、VEGFR-2和PD-L1外，不過度表達(dá)HER2,。對(duì)A431和KPL-4細(xì)胞進(jìn)行熒光成像顯示Alexa 488–Herceptin染色KPL-4細(xì)胞的膜表面,，其熒光比A431細(xì)胞強(qiáng)得多(圖2b)。在Alexa 488–Erbitux的情況下,，A431和KPL-4細(xì)胞的膜表面都被染色(圖2b),。這一觀察與A431和KPL-4細(xì)胞的HER2和EGFR表達(dá)水平一致(圖2a)。Alexa 488–Cyramza和Alexa 488–抗PD-L1 ab也對(duì)A431和KPL-4細(xì)胞膜進(jìn)行了染色,，盡管它們的熒光發(fā)射比Alexa 488–Herception和Alexa 488–Erbitux染色的弱(圖S4),。細(xì)胞成像顯示A431和KPL-4細(xì)胞在其細(xì)胞表面表達(dá)膜蛋白HER2、EGFR,、VEGFR-2和PD-L1,，盡管它們?cè)贏431和KPL-4細(xì)胞中的表達(dá)水平不同。

圖2: (a)A431和KPL-4細(xì)胞中HER2,、EGFR,、VEGFR-2和PD-L1表達(dá)水平的蛋白質(zhì)印跡分析。(b)A431和KPL-4細(xì)胞用Alexa488-Herceptin和Alexa488-Erbitux染色后的熒光圖像,。

圖S4：A431和 KPL-4 細(xì)胞用Alexa488-Cyramza 和 Alexa488-PD-L1染色后的熒光圖像,。

對(duì)制備的四種ICG-抗體共軛物的光學(xué)特性進(jìn)行進(jìn)一步的探索，作者發(fā)現(xiàn)ICG-Herceptin在1000納米以上的SWIR熒光強(qiáng)度比其在830納米的NIR熒光強(qiáng)度弱至少20倍,。然而,，ICG-Herceptin的SWIR熒光具有足夠的強(qiáng)度，可以通過使用InGaAs CCD相機(jī)進(jìn)行探測,。ICG-Herceptin共軛物在水中的SWIR熒光量子產(chǎn)率約為0.5%,。圖3b顯示了含有ICG-Herceptin水溶液(2 μM)的毛細(xì)管的SWIR熒光圖像。這些圖像是用波段濾光片(1000±15納米,，1100±15 nm和1300±15納米),，其中ICG的激發(fā)波長被設(shè)定為785納米。盡管ICG-Herceptin的SWIR熒光強(qiáng)度隨著檢測波長的增加而降低,，但其SWIR熒光可在1000-1300nm的波長范圍內(nèi)被檢測到,。為了檢查SWIR區(qū)域的光散射，我們檢測了通過瓊脂糖凝膠的SWIR熒光,。圖3c顯示了ICG–Herceptin (2μM)的NIR和SWIR熒光發(fā)射的比較,。這些圖像是用含有ICG-Herceptin水溶液的毛細(xì)管(直徑0.5毫米) 拍攝的，其熒光穿過包含脂肪乳劑的1%瓊脂糖凝膠(厚度:0,、1和2毫米),。由于散射，ICG-Herceptin的近紅外熒光圖像隨著瓊脂糖凝膠厚度的增加而模糊,，相比之下,，ICG-Herceptin的SWIR 熒光圖像不那么分散，因此與在NIR區(qū)域拍攝的熒光圖像相比,，熒光圖像更清晰,。SWIR熒光圖像的半峰全寬比NIR熒光圖像的小三倍(圖3c中的下圖)。與凝膠中的NIR熒光相比,，SWIR熒光的散射更低,，因此圖像更清晰。盡管ICG的SWIR熒光與其NIR熒光相比非常弱,，但由于SWIR區(qū)域的組織散射和自熒光較低,，SWIR熒光圖像的信號(hào)與背景對(duì)比度較高(圖3c),。

圖3: (a)ICG-Herceptin的激發(fā)和發(fā)射光譜。(b)充滿ICG-Herceptin的毛細(xì)管的SWIR熒光圖像,。(c)填充有ICG-赫賽汀的毛細(xì)管的近紅外熒光(830納米)和SWIR熒光(> 1000納米)圖像,，熒光穿過含有1%脂肪乳的瓊脂糖凝膠(厚度:0、1和2毫米),。下方圖片顯示了穿過2 mm厚度的瓊脂糖凝膠的SWIR圖像的強(qiáng)度分布,。

然后，作者在小鼠中使用ICG-抗體共軛物進(jìn)行了近紅外和SWIR腫瘤成像,，發(fā)現(xiàn)SWIR腫瘤成像中的信號(hào)與背景對(duì)比度比近紅外腫瘤成像好1.5-2倍,。通過將人乳腺腫瘤細(xì)胞(KPL-4)31植入裸鼠來制備乳腺腫瘤承載小鼠。腫瘤的直徑約為5毫米(圖4a),。在向攜帶乳腺腫瘤的裸鼠的尾靜脈注射ICG-Herceptin后的第0,、1和3天拍攝NIR和SWIR熒光圖像(圖4b)。注射ICG-Herceptin后,，立即從肝臟觀察到ICG的強(qiáng)熒光信號(hào),，而從乳腺腫瘤僅檢測到弱熒光信號(hào)。注射ICG-Herceptin一天后,，清晰地觀察到乳腺腫瘤的NIR和SWIR熒光,。注射后三天，大部分ICG-Herceptin積聚到乳腺腫瘤,，導(dǎo)致腫瘤產(chǎn)生強(qiáng)烈的熒光效應(yīng),。為了研究ICG-Herceptin在乳腺腫瘤中的主動(dòng)積累，進(jìn)行了一項(xiàng)使用ICG-正常IgG的對(duì)照實(shí)驗(yàn),。在這種情況下,，與注射ICG-Herceptin的小鼠相比，沒有從乳腺腫瘤中觀察到明顯的SWIR熒光 (圖4b中的右圖),。注射后三天腫瘤的NIR和SWIR熒光圖像的比較顯示,，SWIR腫瘤圖像的信號(hào)對(duì)背景(S/B)對(duì)比度比NIR腫瘤圖像高1.5倍(圖4c)。SWIR 熒光圖像中的低背景信號(hào)(圖4b)是由SWIR區(qū)域中的低組織自熒光引起的,，此外,，我們檢查了被其他類型的分子成像探針染色的乳腺腫瘤的圖像對(duì)比度的差異，ICG-Erbitux,、ICG-Cyramza和ICG-抗PD-L1偶聯(lián)物(圖4d),。在所有情況下，SWIR熒光圖像的信噪比比NIR熒光圖像高1.8-2.0倍,。

圖4:  (a)帶有乳腺腫瘤的裸鼠的明場圖像,。紅色圓圈表示乳腺腫瘤的位置。(b)尾靜脈注射ICG-Herceptin后裸鼠的近紅外(830納米)和SWIR (>1000納米)熒光圖像,。右圖顯示了小鼠乳腺腫瘤的離體SWIR熒光圖像,，其中小鼠靜脈注射ICG-Herceptin和ICG-正常IgG,。ICG-正常的IgG被用作陰性對(duì)照。(c)乳腺腫瘤的SWIR和近紅外熒光圖像的信噪比,。(d)注射ICG-Erbitux,、ICG-Cyramza和ICG-PDL1抗體三天后拍攝的乳腺腫瘤的近紅外和SWIR熒光圖像。

為了評(píng)估SWIR熒光對(duì)腫瘤的檢測靈敏度,，我們對(duì)不同大小的乳腺腫瘤(直徑約2毫米至8毫米)進(jìn)行了SWIR熒光成像,。注射ICG-Herceptin三天后,，拍攝乳腺腫瘤SWIR熒光圖像(圖5a),。接下來，我們?cè)u(píng)估了檢測腫瘤特異性膜蛋白表達(dá)水平的檢測靈敏度,。對(duì)帶有大小相似的皮膚和乳腺腫瘤的裸鼠進(jìn)行SWIR熒光成像,。如圖5b所示，使用ICG-Herceptin的SWIR熒光成像顯示,，乳腺腫瘤的熒光強(qiáng)度比皮膚腫瘤高約3倍(圖5b中的左圖),。這一結(jié)果表明，與皮膚腫瘤相比,，HER2在乳腺腫瘤中的表達(dá)更高,。使用ICG-Erbitux的SWIR熒光成像顯示EGFR的表達(dá)水平在兩種不同的腫瘤中是相似的(即圖5b中的右圖像)。這些觀察結(jié)果與A431和KPL-4細(xì)胞的蛋白質(zhì)印跡分析結(jié)果一致(圖2a),。因此,，使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像對(duì)于檢測腫瘤中膜蛋白的不同表達(dá)水平具有高靈敏度。

圖5:  (a)不同大小的乳腺腫瘤(直徑2毫米至8毫米)的明場和SWIR熒光(> 1000納米)圖像,。紅色的虛線圓圈表示乳腺腫瘤的位置,。(b)帶有乳腺腫瘤(KPL-4)和皮膚腫瘤(A431)的裸鼠的明場和SWIR熒光圖像。

接著,，為了對(duì)腫瘤血管生成進(jìn)行雙色SWIR熒光成像,，作者使用了兩種類型的SWIR熒光探針：ICG-Herceptin和PbS量子點(diǎn)(QDs)。首先,，將ICG-Herceptin靜脈注射到患有乳腺腫瘤的小鼠體內(nèi),。三天后將ICG-Herceptin注射液、谷胱甘肽包埋的水分散性PbS QDs靜脈注射給荷瘤小鼠,。注射PbS量子點(diǎn)后,，立即進(jìn)行雙色SWIR熒光成像。通過使用ICG (ex:785nm)和PbS QDs (ex:975 nm)的SWIR雙色熒光,，腫瘤和新生血管分別在SWIR區(qū)域可視化(圖6),。應(yīng)該注意的是，小腫瘤(直徑約4mm))中的新生血管存在于腫瘤的外圍(圖6a),，而大腫瘤(直徑約10毫米)的新生血管存在于腫瘤的外圍和內(nèi)部(圖6b),。這些結(jié)果表明雙色SWIR熒光成像能夠光學(xué)檢測腫瘤以及腫瘤血管生成,。

圖6: 裸鼠乳腺腫瘤和新血管的雙色SWIR熒光圖像。腫瘤直徑約為4毫米(a)和10毫米(b),。乳腺腫瘤用ICG-Herceptin染色,。來自腫瘤的SWIR熒光(青色)通過785納米的激發(fā)在1000納米以上的波長被檢測到。通過小鼠尾靜脈注射谷胱甘肽包埋的PbS量子點(diǎn)來觀察新血管,。新血管的SWIR熒光(紅色)是通過975納米激發(fā)在1300±15納米檢測到的,。

最后，作者發(fā)現(xiàn)使用ICG-抗體共軛物的SWIR熒光成像有可能應(yīng)用于人類癌癥腫瘤的光學(xué)診斷,。圖7展示了使用抗癌藥物(Kadcyla)（恩美曲妥珠單抗）治療乳腺腫瘤(KPL-4)腫瘤縮小的時(shí)間歷程SWIR熒光成像,。Kadcyla是一種用于HER2陽性癌癥治療的抗體-藥物共軛物，Kadcyla含有抗HER2抗體(Herceptin),， HER2陽性乳腺腫瘤用ICG- Herceptin (0.2毫克)染色,。注射ICG- Herceptin兩天后，乳腺腫瘤的SWIR熒光清晰可見,，腫瘤直徑約為5毫米(圖7),。在用Kadcyla (0.2 mg)治療的帶有乳腺腫瘤的小鼠中，腫瘤大小明顯減小(圖7a和S8 ):在注射Kadcyla的第9天后,，腫瘤大小減小到直徑約2 mm,。這一結(jié)果表明， Kadcyla治療可以誘導(dǎo)HER 2陽性乳腺腫瘤細(xì)胞凋亡,。相比之下,，在未經(jīng)Kadcyla治療的小鼠中，乳腺腫瘤的大小逐漸增大 (圖7b),。

圖7：用(a)和不用(b)Kadcyla(0.2毫克)治療的乳腺腫瘤的SWIR熒光(> 1000納米)圖像,。在注射ICG-赫賽汀兩天后， Kadcyla被靜脈注射到患有乳腺腫瘤的小鼠體內(nèi),。這些圖像是在注射Kadcyla后0,、3、6和9天拍攝的,。在Kadcyla治療后,，對(duì)9天的小鼠拍攝乳腺腫瘤的離體明場圖像。

參考文獻(xiàn)

Setsuko Tsuboia and Takashi Jin. Shortwave-infrared (SWIR) fluorescence molecular imaging using indocyanine green–antibody conjugates for the optical diagnostics of cancerous tumours[J]. The Royal Society of Chemistry,2020, 10, 28171–28179

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