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多孔細胞培養(yǎng)板的密閉和污染問題
多孔細胞培養(yǎng)板在進行細胞操作時同樣遵循嚴格無菌的原則,，各項操作要保證規(guī)范,、科學,，不對細胞的生長造成額外的影響,。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細胞的均勻和盡量減少換液對細胞生長狀態(tài)的影響,。
多孔細胞培養(yǎng)板的加樣和操作：
細胞培養(yǎng)板在進行細胞操作時同樣遵循嚴格無菌的原則,，各項操作要保證規(guī)范、科學,，不對細胞的生長造成額外的影響,。這其中最常見的問題就是如何保證加樣后細胞的均勻和盡量減少換液對細胞生長狀態(tài)的影響。
問：
96,，24孔培養(yǎng)板或培養(yǎng)皿的蓋子都很松,，這樣是方便了透氣，但是細菌、霉菌等污染物會不會也隨著溜進去呢,？
答：
蓋子很松,，屬于半開放培養(yǎng)，這樣的目的是透氣(實際上是為了使培養(yǎng)皿外的CO2能夠與培養(yǎng)皿充分交換,，維持培養(yǎng)基的pH值),。
凡事有利必有弊，這樣當然增加了污染的可能性,。此外這樣還會使培養(yǎng)皿內(nèi)的液體蒸發(fā),，這對于精確定量的藥物來說就顯得值得注意了。所以以下二條措施是必須的a培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須清潔(定期紫外線照,，酒精擦洗,，盡量少開關(guān)培養(yǎng)箱)b培養(yǎng)箱內(nèi)的濕度必須始終保持為100%(培養(yǎng)箱內(nèi)放置無菌蒸餾水的水槽)。
就好像培養(yǎng)皿,，也是一個蓋倒扣的容器,，也不會污染。主要是因為蓋子“L”型邊緣產(chǎn)生氣流負壓的緣故,，灰塵上面才附著有微生物,，而氣流攜帶的灰塵是無法通過產(chǎn)生負壓的蓋邊緣的。而透氣作用只是通過空氣的擴散,，不會產(chǎn)生氣流,，所以只會透氣不會透菌。
問：
使用24孔板,，在其中的某些孔中有操作(在超凈臺內(nèi)),，而其他孔中還有細胞要培養(yǎng).我很擔心這樣會污染,，不知道要注意什么?
答：
在超凈臺內(nèi)如果操作規(guī)范的話應(yīng)該可以的,，我想你可以充分利用培養(yǎng)版的蓋子，盡量只暴露要操作的孔,，將其他孔用蓋子蓋起來,。
使用前綜合考慮一下，充分使用所有的孔,；如果只需要使用少數(shù)的孔可以只用一邊的,，其余用蓋子蓋住，我習慣于先用右側(cè)的孔(右手加樣方便),。
操作時用幾塊玻片把板子一側(cè)墊高,，不要把蓋子全打開，一般沒問題,。
細胞分布不均及解決辦法
問：
細胞接種培養(yǎng)板,，細胞總是聚集在周邊部分，該如何處理啊,？
答：
請問你的細胞是如何混勻的,？是滴管吹打還是振蕩培養(yǎng)板？如果是后者,，而且是轉(zhuǎn)圈搖勻的話,，很有可能由于離心力的作用使細胞甩到周邊部分，導致細胞中間少,，四周多,！
這里提供一個好辦法：在培養(yǎng)種板之前，把培養(yǎng)板放入培養(yǎng)箱里進行幾個小時的飽和后再取出,，種入細胞時力量要輕,，可采取用滴頭在培養(yǎng)板孔的側(cè)面慢慢加入讓細胞懸液流入板孔中，培養(yǎng)的細胞基本是均勻生長,。記住千萬不要用振蕩器振蕩,，否則你的細胞就會想你說得那樣聚積在一起。
培養(yǎng)板孔直徑愈小,，這個現(xiàn)象越明顯,，24、96孔板這種現(xiàn)象不可避免,，因為液體的附壁使得孔內(nèi)培養(yǎng)液不是成一個液平面,，而是周邊高，就像凹鏡一樣,，而使用這兩種孔板由于需要加干預(yù)等原因而不能加足量培養(yǎng)液,，使得細胞隨培養(yǎng)液一起出現(xiàn)“邊集”現(xiàn)象，如果為了使孔中央也有均勻細胞而增加接種細胞數(shù)量的話,，這要看你需要觀察何種指標,，如果是MTT，免疫組化的話會因為細胞成層而影響結(jié)果,。
消化細胞時要注意吹打均勻,，避免細胞成團，而且孔內(nèi)培養(yǎng)液量要足夠,，一般接種時加足量培養(yǎng)液,，加干預(yù)時換一次液，干預(yù)液加培養(yǎng)液量等于接種時培養(yǎng)液量,，這樣的話“邊集”現(xiàn)象會有所改觀,，不妨一試。
問：
我做的是空斑形成實驗,，最好是細胞鋪成均勻的一層,，,，可接種病毒時大部分孔都還好，個別的不太均勻,。細胞組內(nèi)差異很大,，想請教一下大家加細胞的時候都有什么方法呀？
答：
細胞消化后吹打成單細胞懸液很關(guān)鍵,！保證分板時每個孔的細胞數(shù)目是一致的,！
當然還有處理因素各個孔之間的平行也很重要，比如說加藥時,，藥物稀釋后混勻,，保證每個孔的濃度是一致的！
再者加細胞和藥物時,，要試驗組和對照組一塊輪流加,，避免加樣先后順序?qū)е录毎芏群退幬餄舛鹊牟町悾?br />
問：
吹打已經(jīng)是均勻了，但是鋪板,，6孔,，24孔總有些不均勻，有點往中間集中,。而且明明計數(shù)好了鋪,，長一兩天，各個孔密度又不一樣,，對檢測有影響,，有良策嗎？
答：
如果用巴氏吸管鋪的話,，每次吸取的量不要太多,，因為吸管內(nèi)的細胞會自動向下沉，往往第一開始幾個孔細胞數(shù)多,，經(jīng)常均勻細胞懸液,，加液走S型路線。
如果用移液器的話,，tips要處理下,，把去掉避免損傷細胞,，這樣每一次取液對應(yīng)一個孔,。用tip一對一孔加入比較準確。但也要注意混勻懸液,。
設(shè)立平行組,，n要足夠大(可以計算一下)。
鋪板后不要搖,，因為搖動會導致細胞向中間聚集,。最好鋪板一次搞定,。