SDR是否可以測量外部代謝產(chǎn)物對葉片O 2消耗率的影響,。具體而言，先前在代謝物對葉片O 2消耗速率的影響（使用Astec Global的Q2）中進行了觀察,，觀察到10 mM脯氨酸（Pro）在14小時內(nèi)引起大約兩倍的呼吸速率刺激,。該測量的關(guān)鍵方面是持續(xù)時間（> 14小時）及其動態(tài)性質(zhì)，因為我們對速率隨時間的變化感興趣,。我采用了SDR設(shè)置,，因此可以測量包含樣品的試管頂部空間中的氧氣。
背景：需要進行植物呼吸測量
呼吸通量和光合速率是常規(guī)適用于植物的代謝通量測量方法,，因此兩者都是了解植物生物化學和理學的關(guān)鍵工具,。當前存在幾種可以測量植物呼吸氣體交換速率的技術(shù)，例如用于CO 2的紅外氣體分析儀和用于氧氣的Clark型O 2電極,。兩種技術(shù)都具有低通量和持續(xù)時間短的測量技術(shù),，這阻礙了大規(guī)模的實驗設(shè)計，例如,，這些實驗設(shè)計將用于植物育種者,。澳大利亞研究委員會植物能量生物學中心（PEB）一直處于開發(fā)和試用用于植物的新呼吸測量技術(shù)的前沿。具體來說,，使用O2依賴于熒光的猝滅已被用于多種高通量技術(shù),，例如SDRSensorDish®Reader，Seahorse或Astec Global的Q2,。然而,，在植物科學中很少使用這些技術(shù),，特別是海馬使用漂浮的植物組織的應(yīng)用受到限制[1]。盡管我們已經(jīng)嘗試過將標準SDR與先前帶有傳感器斑點的玻璃板結(jié)合使用,，但是斑點在井底的位置與涉及液體和頂部空間的測量不兼容,。目前，PEB的許多呼吸研究均依賴于第二季度,。該機器基本上使用自己版本的傳感器點,，這些傳感器點位于頂部螺旋管的蓋子和自動傳感器臂中。Q2可以很好地與各種植物組織配合使用,，并且可以大大提高測量能力,，如Scafaro et al。,，2017 [2]中所評估,。簡單的管和蓋設(shè)置也適用于液體介質(zhì)的測量。這是一個很大的優(yōu)勢,，因為它允許將化學物質(zhì)引入呼吸測定法,，從而大大擴展了其用途[3]。因此,，我想測試SDR是否可以與Q2搭配類似的設(shè)置（帶有管和傳感器點帽）,，以及它是否具有*的測量性能。
圖1：SDRSensorDish®閱讀器設(shè)置,，用于葉盤呼吸測量,。將葉片切開并漂浮在固定在底部架子上的螺帽管內(nèi)的緩沖介質(zhì)上。旋緊瓶蓋,。頂部機架適配器已放置在上面,。特別提款權(quán)倒掛。
材料與方法
實驗設(shè)置簡單,，快速（圖1）,。當總?cè)萘繛?56 µL的塑料螺帽管充滿600 µL緩沖溶液（50 mM HEPES，10 mM MES,，200 µM CaCl 2,，pH 6.6）在存在或不存在10 mM Pro（或所需的任何其他化學物質(zhì)）的情況下，留有256 µL的空氣頂空,。將7毫米的葉盤打孔并漂浮在溶液上,，并蓋上管蓋（n = 10）。所有測定中均應(yīng)包括無葉盤的空白試管,，因為它們必須去除大量背景噪音并提高數(shù)據(jù)質(zhì)量,。然后使用兩個3D打印適配器（PreSens）組裝SDR。一個SDR大約需要15分鐘的設(shè)置時間。提供的蓋子和管子是高質(zhì)量的,?？紤]到適配器的小設(shè)計，該單元的組裝非常堅固,。在室溫下黑暗中收集氧氣數(shù)據(jù),。該測定以15秒的間隔進行過夜（?17小時）。數(shù)據(jù)已導出到Excel進行分析,。
結(jié)果
圖2顯示了一項實驗的氧氣測量結(jié)果,，該實驗比較了用SDR記錄的未經(jīng)處理的葉片與經(jīng)過Pro處理的葉片。這些值用于進一步的消耗率計算,。我通過減去無葉盤的空白試管中的平均消耗率來校正O 2消耗率隨時間的變化,。然后將速率計算為移動1.5小時窗口（圖3A-B）。O 2消耗率軌跡隨時間的平滑度是用于計算移動斜率的時間窗口的函數(shù)：更大的窗口等于更平滑的軌跡,。但是,，出于本實驗的目的，空白消減后殘留的噪聲不是一個因素,。根據(jù)Scafaro等人的方法,，將O 2百分比轉(zhuǎn)換為摩爾值。2017 [2],。
圖2：用SDR記錄的未經(jīng)處理（左）和經(jīng)過Pro處理（右）葉盤的氧氣測量值,。一個實驗的數(shù)據(jù)。經(jīng)Pro處理的葉盤的刺激呼吸清晰可見,。
結(jié)果表明,，SDR板與管和蓋的設(shè)置相結(jié)合，再現(xiàn)了以前使用Q2獲得的結(jié)果,。對照葉片中O 2的消耗率隨時間逐漸下降（圖3A，C）,。在Pro處理過的圓盤中,，如預期的那樣，從開始孵育4小時開始,，O 2消耗率隨時間增加（圖3B,，C，D）,。在圖3D中,，我們比較了兩種不同的擬南芥基因型。該測定法能夠通過重復六次檢測先前觀察到的品系間表型差異,。
資料品質(zhì)
關(guān)鍵因素是測量之間的技術(shù)差異,。與其他呼吸測量設(shè)備相比，對照治療的重復痕跡顯示出較低的技術(shù)變異：變異系數(shù)為22.7％（其中包括生物學變異，因此潛在的技術(shù)變異更低）,。較低的CV至關(guān)重要,，因為它使確定具有合理重復次數(shù)的樣品類型之間的差異變得更加容易。在Pro處理過的葉盤中,，由于生物變化,，對Pro的響應(yīng)在葉盤中不太均勻，因此可以預料到Pro處理過的葉盤中O 2消耗率的變化會增加,。
15 s的測量頻率足以解決數(shù)據(jù)中隨時間變化的模式,。通過將設(shè)備放置在培養(yǎng)箱中來控制溫度的能力是植物呼吸研究的另一個優(yōu)勢。
圖3：暴露于外源性化學物質(zhì)時葉盤中O 2消耗率的測定,。在有或沒有10mM Pro的條件下孵育擬南芥葉盤,，并在約15小時的黑暗中測量O 2耗竭率。通過減去含有緩沖液但沒有葉盤的四個試管的平均速率來校正速率,。（A,，B）對照和Pro處理的WT葉盤的單個跡線（n = 10）。（C）來自A和B的平均跡線,。（D）來自Pro和對照處理的WT和突變株的平均跡線,，相對于未處理的WT速率顯示（n = 6）。突變株顯示出部分缺乏Pro的呼吸刺激,。
6
立即詢價
您提交后,，專屬客服將第一時間為您服務(wù)