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α-葡萄糖苷酶（α-GC）活性檢測(cè)試劑盒（微量法）

注意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1016

產(chǎn)品規(guī)格：100管/48樣

產(chǎn)品內(nèi)容：

提取液：液體100mL×1瓶,，4℃保存。

試劑一：粉劑×1瓶,，-20℃保存；臨用前每瓶加入12mL雙蒸水,，充分溶解備用,；用不完的試劑仍-20℃保存,。

試劑二：液體15mL×1瓶，4℃保存,。

試劑三：液體15mL×1瓶,，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體×1支,，5μmol/mL的對(duì)硝基苯酚溶液,。

產(chǎn)品說(shuō)明：

α-GC(EC 3.2.1.20)廣泛存在于動(dòng)物、植物,、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中,，催化水解芳基或烴基與糖基之間的α-糖苷鍵生成葡萄糖，不僅與細(xì)胞壁的松弛或加固有關(guān),，而且與細(xì)胞識(shí)別和一些信號(hào)分子產(chǎn)生密切相關(guān),。

α-GC 分解對(duì)-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成對(duì)-硝基苯酚，后者在400nm有最大吸收峰,，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-GC 活性,。

需自備的儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、微量玻璃比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。

操作步驟：

一,、粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞的處理：收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清,；按照每1000萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20％,，超聲3秒,，間隔10秒，重復(fù)30次）,，15000g,，4℃，離心20min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、組織的處理：稱(chēng)取約0.2g組織,，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,；15000g，4℃,，離心20min,，取上清，置冰上待測(cè),。

3,、標(biāo)準(zhǔn)樣品的準(zhǔn)備：取100μL標(biāo)準(zhǔn)液，加入到400μL 試劑三中,，得到1μmol/mL標(biāo)準(zhǔn)液,，十倍稀釋到100nmol/mL，用蒸餾水倍比稀釋?zhuān)?/span>50,、25,、12.5、6.25,、0 nmol/mL,。100、50,、25,、12.5、6.25,、0 nmol/mL做標(biāo)準(zhǔn)液,。

二、測(cè)定步驟和加樣表：

1. 分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至400nm,，蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表

充分混勻,，放入37℃準(zhǔn)確水浴30min后,，立即放入沸水浴中煮沸5min（蓋緊，以防止水分散失）,，流水冷卻后充分混勻（以保證濃度不變）

充分混勻，8000g,，4℃,，離心5min，取上清液（在EP管或96孔板中加入下列試劑）

充分混勻，室溫靜置2min后,， 400nm處測(cè)定吸光值A,，計(jì)算ΔA=A測(cè)定管-A對(duì)照管,。

三,、α-GC 活力計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)管的濃度（y）和吸光度（x,，各標(biāo)準(zhǔn)管減去濃度為0的標(biāo)準(zhǔn)管為標(biāo)準(zhǔn)管A）,，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2,、根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線,，將ΔA（x）帶入公式計(jì)算樣品產(chǎn)物濃度（nmol/mL）。

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白在每mL體系中每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

GC 活力(U/mg prot)=(y×V反總)÷(V樣×Cpr)÷T=18.67×y÷Cpr

需要另外測(cè)定,，建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織在每mL體系中每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

GC 活力(U/g鮮重) = (y×V反總)÷(W×V樣÷V樣總)÷T=18.67×y÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞在每mL體系中每小時(shí)產(chǎn)生1nmol對(duì)-硝基苯酚定義為一個(gè)酶活力單位,。

GC 活力(U/10⁴ cell)=(y×V反總)÷(1000×V樣÷V樣總)÷T=0.0187×y

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；V反總：反應(yīng)體系總體積,，0.28mL；V樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積,，0.03mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；W：樣品質(zhì)量,，g；1000：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),，1000萬(wàn),；T：反應(yīng)時(shí)間，0.5h,。