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His-Tagged Protein Purification Kit (Soluble Protein)

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）

產(chǎn)品貨號(hào)：26421（5ml）

產(chǎn)品簡介：

His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒（可溶性蛋白）包含Ni-Agarose填料,、親和柱空柱以及可溶性His融合蛋白純化所需的全部試劑（細(xì)菌裂解液、蛋白酶抑制劑混合物,、結(jié)合緩沖液和洗脫緩沖液組分）,，使用方便。該鎳柱純化系統(tǒng)對(duì)6×His-tag蛋白具有顯著特異吸附能力,，能夠高效一步純化帶有6個(gè)組氨酸親和標(biāo)簽的蛋白,。該系統(tǒng)具有4個(gè)Ni²⁺螯合位點(diǎn)，較只有3個(gè)螯合位點(diǎn)的Ni-IDA結(jié)合Ni²⁺ 更為牢固,，有效防止純化過程中Ni²⁺脫落且增強(qiáng)對(duì)His標(biāo)簽蛋白的結(jié)合能力,，提高純化效率。較高的基團(tuán)密度,，大大提高了蛋白載量,。該系統(tǒng)在天然或變性條件下，對(duì)來源于各種表達(dá)系統(tǒng)（如桿狀病毒,，哺乳細(xì)胞,，酵母以及細(xì)菌）中的His標(biāo)簽蛋白，均有很好的純化效果,。本產(chǎn)品已螯合鎳離子,，可直接用可溶性蛋白的純化，使用方便,，快捷,。

支持物： CL-6B瓊脂糖凝膠

載量： 20-30 mg His標(biāo)簽蛋白/ml填料

粒徑： 50-160 µm

產(chǎn)品內(nèi)容：

操作步驟：

Ⅰ緩沖液的準(zhǔn)備    

可溶性蛋白純化緩沖液配方：

Ⅱ組裝層析柱

1. 將Ni-Agarose Resin填料混勻后加入層析柱,，室溫靜置10分鐘，待凝膠與溶液分層后,， 把底部的出液口打開,，讓乙醇通過重力作用緩慢流出,。

注意：

1）填料的上層是乙醇保護(hù)層，將填料和乙醇一起混勻,，以每ml填料純化20-30mg His標(biāo)簽蛋 白計(jì)算,，取需要的填料與乙醇的混合液加入層析柱,。

2）如果乙醇不流出,，可以給柱子一個(gè)外力,，例如用大拇指對(duì)柱口輕輕按壓一下，迫使乙醇流出,。

3）本實(shí)驗(yàn)都是通過重力作用使溶液流出,。

2. 向裝填好的柱中加入5倍柱體積的去離子水將乙醇沖洗干凈后，再用10倍柱體積的 Binding Buffer平衡柱子,，平衡結(jié)束后即可上樣,。

注意：柱體積指的是填料的體積。

Ⅲ可溶性蛋白的純化

1. 收集菌體后,，每100 mg菌體（濕重）加入1-5 ml細(xì)菌裂解液（每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中已加入10 μl 蛋白酶抑制劑混合物）,，超聲裂解菌體。

注意：

1）當(dāng)提取物粘度高或提取蛋白為包涵體時(shí),，建議加入DNase I和Lysozyme,。每1 ml 細(xì)菌抽提試劑中加入1 μl DNase I（1,000 U/ml），2 μl Lysozyme（50 mg/ml）,。

2）超聲過程中保持菌液處于冰浴中,，超聲條件依賴于所使用的超聲儀功率，探頭種類,，容器的大小形狀,，需實(shí)驗(yàn)中自己摸索，應(yīng)避免連續(xù)超聲導(dǎo)致的大量產(chǎn)熱,，可分成短時(shí)間,，多次超聲，通過一定的間隔時(shí)間避免溶液過熱,。最終菌液變清即可,。

2. 10000 rpm,4℃離心3分鐘，收集上清中的可溶性蛋白,。

3. 用Binding Buffer將菌體裂解液等倍稀釋后負(fù)載上柱,，流速為10倍柱體積/小時(shí)，收集流穿液,。

注意：

1）本試劑盒中附帶有一塊篩板,，使用時(shí)先將篩板加至填料的上層，該篩板可用于雜質(zhì)較多的蛋白的過濾,，防止過多的雜蛋白堵塞柱子的作用,。再將處理好的樣品負(fù)載上柱，但是篩板放入柱子后就不易取出,。

2）通過控制加入的菌體裂解液的速度來控制流速,。

4. 使用15倍柱體積的Soluble Binding Buffer沖洗柱子,，洗去雜蛋白。

5. 使用適量Soluble Elution Buffer洗脫,，收集洗脫峰,。

  注意：洗脫峰可以分管收集，每1 ml收集1管,，并采用蛋白監(jiān)測儀監(jiān)測,，收集洗脫峰

6. 洗脫后，依次使用10倍柱體積的去離子水洗滌柱子,，再用3倍柱體積的20%乙醇平衡（乙醇要將填料浸沒）,，封柱后2-8℃保存。

  注意：如果是分段梯度洗脫,，最大洗脫緩沖液中咪唑濃度未達(dá)到500 mM時(shí),，則使用濃度為500 mM的咪唑進(jìn)行洗脫10倍柱體積后，再進(jìn)行第6步的操作

Ⅳ柱再生

當(dāng)填料使用多次后,，結(jié)合效率會(huì)有所下降（表現(xiàn)為流速變慢或填料失去藍(lán)綠色）,， 可以用以下方法再生，提高填料的使用壽命和蛋白質(zhì)的結(jié)合效率,。

1. 使用2倍柱體積的6 M鹽酸胍沖洗后,，使用3倍柱體積的去離子水沖洗。

2.  使用1倍柱體積的2% SDS沖洗,。

3.  依次使用1倍柱體積的25%,、50%、75%和5倍柱體積的100%乙醇沖洗,，再依次使用1倍柱體積的75%,、

50%和25%的乙醇沖洗。

4. 使用1倍柱體積的去離子水沖洗,。

5.  使用5倍柱體積含50 mM EDTA緩沖液（PH8.0）沖洗,。

6.  使用3倍柱體積去離子水，3倍柱體積20%乙醇沖洗,。

7.  2-8°C保存,。

8. 再次使用前，需首先使用10倍柱體積去離子水沖洗,，然后使用5個(gè)柱體積的50 mM NiSO₄再生,，3個(gè)柱體積的Binding Buffer平衡。

注意事項(xiàng)：

1. 在純化之前采用電泳檢測蛋白的可溶性,，本試劑盒只適合于可溶性蛋白的純化,。

2. 緩沖液中不建議使用β-巰基乙醇、DTT和EDTA,。

3. 整個(gè)純化過程中切忌凝膠脫水變干,。

4. 為提高純化效率,，首先確定Binding Buffer和Elution Buffer中咪唑的最佳使用濃度。必要時(shí)可以使用線性或梯度濃度的咪唑濃度,，Binding Buffer的范圍為0-10 mM,，洗脫緩沖液的范圍為10-500 mM來進(jìn)行。并通過SDS-PAGE或Western Blotting來檢測目的蛋白的純度,。

5. 請(qǐng)使用高純度的試劑配制緩沖液,，并通過0.22µm或者0.45µm過濾器過濾,。為避免柱子被堵塞,，建議將裂解液進(jìn)行離心，或者使用0.22µm或者0.45µm過濾器過濾,。

6. 柱再生時(shí),，保證每步洗完后都要用足夠的去離子水沖洗至中性。