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3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)活性檢測(cè)試劑盒

（微量法）

正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定,。

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1002

產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣

測(cè)定意義：

      GAPDH催化3-磷酸甘油醛氧化生成1,3-二磷酸甘油酸，是糖酵解途徑的關(guān)鍵酶,，與糖異生途徑,、體內(nèi)血糖濃 度的維持和糖尿病的發(fā)生密切相關(guān)，在機(jī)體糖,、脂,、蛋白代謝紊亂疾病中發(fā)揮重要作用。

測(cè)定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化三磷酸甘油酸和ATP生成1,3二磷酸甘油酸,。GAPDH逆向催化1,3二磷酸甘油酸和 NADH生成3磷酸甘油醛,、無(wú)機(jī)磷和NAD，340nm處測(cè)定NADH的減少量可反映GADPH活性的高低,。

需自備的儀器和用品：

分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀,、恒溫水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī),、可調(diào)式移液器,、微量石英比色皿/96孔板、研缽,、冰和蒸餾 水,。

試劑的組成和配制：

                             提取液：100mL×1 瓶,，4℃保存；

                             試劑一：粉劑×1 瓶,，-20℃保存,；

                             試劑二：液體20mL×1 瓶，4℃保存,；

                             試劑三：液體×1 支,，4℃保存。

樣本的前處理：

1,、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10 4 個(gè)）：提取液體 積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液）,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴,，功 率 20％或200W，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min,，取上清,，置冰上待測(cè)。

2,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液）， 進(jìn)行冰浴勻漿,。8000g 4℃離心10min,，取上清，置冰上待測(cè),。

測(cè)定步驟：

1,、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至340nm,，蒸餾水調(diào)零,。

2、樣本測(cè)定

（1）工作液的配制：將試劑二全部倒入試劑一瓶中,，充分溶解,，37℃(哺乳動(dòng)物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘； 現(xiàn)配現(xiàn)用,。

（2）在試劑三中加入500μL蒸餾水,，充分混勻待用；用不完的試劑4℃保存一周,。

（3）在微量石英比色皿或96孔板中加入5μL 樣本,、5μL試劑三和190μL工作液,，混勻，加入后一個(gè)試劑的同 時(shí)開始計(jì)時(shí),，記錄340nm處20s時(shí)的吸光值A(chǔ)1和5min20s后的吸光值A(chǔ)2,，計(jì)算 ΔA=A1-A2。

GAPDH 活性計(jì)算：

a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算： 單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(V樣×Cpr) ÷T

                                                  ＝1286×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算 單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(W×V樣÷V樣總) ÷T

                                              ＝1286×ΔA÷W 

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算 單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/104cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                                                ＝2.57×ΔA 

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10 -4 L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3 L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,； V樣：加入樣本體積,，0.005 mL；

V樣總：加入提取液體積,，1mL,；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,， mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬(wàn)

b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(V樣×Cpr) ÷T

                                                 ＝2572×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

單位的定義：每g組織每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位,。

GAPDH（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(W ×V樣÷V樣總) ÷T

                                              ＝2572×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位的定義：每1萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘消耗1nmol的NADH定義為一個(gè)酶活力單位。

GAPDH（nmol/min/10 4cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10 9]÷(500×V樣÷V樣總) ÷T

                                                 ＝5.144×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10 -4 L,；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10 3 L/mol/cm,；d：96孔板光徑,，0.5cm； V樣：加入樣本體積,，0.005 mL,；V樣總：加入提取液體積，1mL,；T：反應(yīng)時(shí)間,，5 min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度， mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù),，500萬(wàn),。