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RIPA 裂解液(強)

產(chǎn)品貨號：T0013B

產(chǎn)品包裝：50ml/100ml/500ml

產(chǎn)品簡介：

  多種成分均可以從細胞中提取總蛋白，如 Triton,、SDS,、NP-40 等,。RIPA 裂解液（強）(RIPA Lysis Buffer) 是采用一種經(jīng)典的細胞組織快速裂解并獲得總蛋白的裂解液,，其裂解強度大于 NP-40 裂解液、RIPA 裂解液(中),。 所獲得的蛋白質(zhì)可用于 Western,，免疫沉淀(Immunol Precipitation，IP)等,。

  Medium RIPA Lysis Buffer 主要由 Tris ,、NP-40、sodium deoxycholate 等組成,，并含有多種蛋白酶抑制劑成分,， 可以有效抑制蛋白的降解，并維持原有的蛋白間相互作用,。

產(chǎn)品組成：

操作步驟（僅供參考）：

(一)貼壁培養(yǎng)細胞

1. 取 Enhanced RIPA Lysis Buffer 室溫溶解混勻,，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM,。

2. 去除貼壁細胞的培養(yǎng)液,，用 PBS、NS 或無血清培養(yǎng)液清洗 1 次,，低速離心,，棄上清， 留取沉淀,。

3. 按照 6 孔板每孔加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,，加入 RIPA Lysis Buffer。移液器輕輕吹打,， 使裂解液和細胞充分接觸,。置于冰上或 4℃裂解，通常裂解液作用于細胞 1～3s 內(nèi),，細胞就會被裂解,。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大裂解液的用量到 200～ 250μl,。

4. 10000～12000g,，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機，室溫下離心亦可),，取上清,。

5. 后續(xù)的 SDS-PAGE、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(二)懸浮培養(yǎng)細胞

1. 取 Weak RIPA Lysis Buffer 置室溫溶解混勻后,，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM,。

2. 低速離心懸浮細胞,，棄上清，收集沉淀,。

3. 用手指輕彈細胞,，使其松散。按照 6 孔板每孔細胞加入 150～250μl 含有 PMSF 的裂解液的比例,，加入 Weak RIPA Lysis Buffer ,。通常 6 孔板每孔細胞加入 150μl 裂解液已經(jīng)足夠，但如果細胞密度非常高可以適當加大 裂解液的用量到 200～250μl,。再用手指輕彈以充分裂解細胞,，充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細胞沉淀。

4. 10000～12000g,，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可)，取上清,。

5. 進行后續(xù)的 SDS-PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

(三)組織樣本

1. 取 Enhanced Lysis Buffer 置于室溫溶解混勻后,，加入 PMSF，使 PMSF 終濃度為 1mM,。

2. 把組織剪切成細小的碎片,，越小越好。 取在液氮或超低溫冰箱中冷凍 30min 以上的組織,，迅速用液氮研磨,， 研磨過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi)，以減少蛋白的降解,。

3. 按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例,，加入含有 PMSF 的裂解液。冰上或 4℃裂解 15～30min,。

4. 步驟 3,、4 亦可以采用如下過程：按照每 20mg 組織加入 150～250μl 裂解液的比例加入含有 PMSF 的 Enhanced RIPA Lysis Buffer。用玻璃勻漿器或組織研磨器勻漿,，直至充分裂解,，該過程盡量控制在 1～2min 之內(nèi),，以 減少蛋白的降解。

5. 10000～12000g,，4℃離心 5～10min(如無低溫離心機,，室溫下離心亦可)，取上清,。

6. 進行后續(xù)的 PAGE,、Western、免疫沉淀和免疫共沉淀等操作,。

注意事項：

1. 去除貼壁細胞的培養(yǎng)液后,，如果血清中的蛋白沒有干擾,，可以不用清洗,。

2. 如果裂解不充分可以適當增加裂解液的用量，如果需要高濃度的蛋白樣品,，可以適當減少裂解液的用量,。

3. 如果細胞量較多，必需分裝成 50～100 萬細胞/離心管,，然后再裂解,。大團的細胞較難裂解充分，而少量的 細胞由于裂解液容易和細胞充分接觸,，相對比較容易裂解充分,。

4. 如果組織樣品本身非常細小，可以適當剪切后直接加入裂解液裂解,，通過強烈 Vortex 使樣品裂解充分,。然 后同樣離心取上清，用于后續(xù)實驗,。

5. 溶解 RIPA Lysis Buffer 時,，應(yīng)盡量縮短溶解時間，避免有效成分失效,。

6. 裂解產(chǎn)物中經(jīng)常會出現(xiàn)一小團透明膠狀物,，屬正常現(xiàn)象,。該透明膠狀物為含有基因組 DNA 等的復(fù)合物,。在 不檢測和基因組 DNA 結(jié)合特別緊密的蛋白的情況下，可以直接離心取上清用于后續(xù)實驗,；如果需要檢測和 基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,，則可以通過超聲處理打碎打散該透明膠狀物，隨后離心取上清用于后續(xù)實驗,。 如果檢測一些常見的轉(zhuǎn)錄因子,，例如 NF-KB,、p53 等時，通常不必進行超聲處理,，就可以檢測到這些轉(zhuǎn)錄因 子,。

7. 細胞裂解的操作步驟，應(yīng)置于冰上或 4℃進行,。

有效期： 12 個月有效,。