順烏頭酸酶(ACO)活性檢測試劑盒(微量法)產(chǎn)品貨號：BA1881產(chǎn)品規(guī)格：100管/96樣產(chǎn)品簡介：順烏頭酸酶(aconitase),，三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化,，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應(yīng),，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上,，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應(yīng)作準備,。ACO催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸,，異檸檬酸氧化脫羧將NAD+還原生成NADH，導致340nm處光吸收上升,。注意：實驗之前建議選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實驗,。如果樣本吸光值不在測量范圍內(nèi)建議稀釋或者增加樣本量進行檢測。產(chǎn)品組成：試劑一：100mL×1瓶，-20℃保存,；試劑二：20mL×1瓶,，-20℃保存；試劑三：1.5mL×1支,，-20℃保存,；試劑四：液體20mL×1瓶，4℃保存,；試劑五：液體5mL×1瓶,，4℃保存；試劑六：粉劑×1支,，-20℃保存,；臨用前加1.5mL蒸餾水充分溶解,；現(xiàn)配現(xiàn)用試劑七：粉劑×1支,，4℃保存；臨用前加12mL試劑四充分溶解,；工作液：臨用前在12mL試劑七中加入1mL蒸餾水,、1mL試劑四、1mL試劑五,、1mL試劑六充分混勻,。需自備的儀器和用品：紫外分光光度計/酶標儀、水浴鍋,、臺式離心機,、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板,、研缽,、冰和蒸餾水。樣本的前處理：1. 組織,、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：2. 稱取約0.1g組織或收集500萬細胞,，加入1mL試劑一和10μL試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿,。3. 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi)600g,，4℃離心5min。4. 棄沉淀,，將上清液移至另一離心管中,，11000g，4℃離心10min,。5. 上清液即胞漿提取物,，可用于測定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。6. 在步驟④的沉淀中加入200μL試劑二和2μL試劑三,，超聲波破碎(冰浴,，功率20%或200W,，超聲3秒，間隔10秒,，重復30次),，用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。測定步驟：1. 分光光度計或酶標儀預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長至340nm,，蒸餾水調(diào)零。2. 樣本測定(1)將工作液,，置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)水浴10min,；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20℃保存,，一星期內(nèi)可用,。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入40μL樣本160μL工作液，混勻,，立即記錄340nm處20s時的吸光值A(chǔ)1和3min20s后的吸光值A(chǔ)2,，計算ΔA=A2-A1。ACO活性計算：a.用微量石英比色皿測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位,。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V樣)÷T=268×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位,。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=54×ΔA÷W(3)按細菌或細胞密度計算單位的定義：每1萬個細菌或細胞每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.108×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積,，2×10-4L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×103L/mol/cm,；d：比色皿光徑,，1cm；V樣：加入樣本體積,，0.04mL,；V樣總：加入提取液體積，0.202mL,；T：反應(yīng)時間,，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度,，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬。b.用96孔板測定的計算公式如下(1)按樣本蛋白濃度計算單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位。ACO活性(nmol/min/mg prot)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(V樣×Cpr)÷T=536×ΔA÷Cpr(2)按樣本鮮重計算單位的定義：每g組織每分鐘生成 1nmol的NADH定義為一個酶活性單位,。ACO(nmol/min/g鮮重)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(W×V樣÷V樣總)÷T=108×ΔA÷W(3)按細菌或細胞密度計算單位的定義：每1萬個細菌或細胞在反應(yīng)體系中每分鐘生成1nmol的NADH定義為一個酶活性單位,。ACO活性(nmol/min/104cell)＝[ΔA×V反總÷(ε×d)×109]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=0.216×ΔAV反總：反應(yīng)體系總體積，2×10-4L,；ε：NADH摩爾消光系數(shù),，6.22×103L/ mol/cm；d：96孔板光徑,，0.5cm,；V樣：加入樣本體積，0.04mL,；V樣總：加入提取液體積,，0.202mL； T：反應(yīng)時間,，3min,；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL,；W：樣本質(zhì)量,，g,；500：細菌或細胞總數(shù),，500萬。