酪氨酸酶活性檢測(cè)試劑盒（可見分光光度法）

產(chǎn)品貨號(hào)：BA1806

產(chǎn)品規(guī)格：50T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

酪氨酸酶（tyrosinase：EC1.14.18.1）是一種單酚單加氧酶,，是具有雙功能的含銅糖蛋白,，廣泛存在于植物、 酵母和動(dòng)物組織中,。酪氨酸酶是生物體合成黑色素的關(guān)鍵酶,，也是引起果蔬酶促褐變的主要因素，同時(shí)也對(duì)昆蟲 的免疫及生長有重要影響,。

酪氨酸酶催化L-多巴生成多巴色素,，其在475nm下有特征吸收峰，進(jìn)而測(cè)定出酪氨酸酶的活性,。

注意：實(shí)驗(yàn)之前建議選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn),。如果樣本吸光值不在測(cè)量范圍內(nèi)建議稀釋或者 增加樣本量進(jìn)行檢測(cè)。

產(chǎn)品內(nèi)容：

溶液的配制：

1. 試劑一：臨用前每瓶加入15mL提取液充分溶解待用,，現(xiàn)配現(xiàn)用,。

需自備的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、低溫離心機(jī),、水浴鍋,、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿,、研缽/勻漿器,、冰、蒸餾水,。

操作步驟：

一,、樣本處理（可適當(dāng)調(diào)整待測(cè)樣本量，具體比例可以參考文獻(xiàn)）

1. 組織：稱取約0.1g組織,，加入1mL提取液進(jìn)行冰浴勻漿,。12000g,，4℃離心20min，取上清,，置冰上待測(cè),。

2. 細(xì)胞或細(xì)菌樣本的制備：先收集細(xì)胞或細(xì)菌樣本到離心管內(nèi)，棄上清,，按照每500萬細(xì)胞或細(xì)菌加入1mL提取液,，超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（功率20%，超聲3s,，間隔10s,，重復(fù)30次）。12000g,，4℃離心20min,，取上清，置冰上待測(cè),。

3. 血清（漿）：直接檢測(cè),。

二、測(cè)定操作

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30min,，波長調(diào)至475nm,。蒸餾水調(diào)零。

2. 加樣表（在1mL玻璃比色皿中分別加入）

充分混勻后立即測(cè)定10s時(shí)在475nm下的吸光度,，記為A1,，之后迅速將其放入37℃（哺乳動(dòng)物）或25℃（其他物種）水浴或培養(yǎng)箱中3min。然后迅速拿出擦凈后測(cè)定190s時(shí)的吸光度,，記為A2,。計(jì)算ΔA=A2-A1。

三,、酪氨酸酶酶活計(jì)算

1. 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位,。

酪氨酸酶（U/mg prot）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(V樣×Cpr)÷T=90.09×ΔA÷Cpr

2. 按樣本質(zhì)量計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位。

酪氨酸酶（U/g 質(zhì)量）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(W÷V提取×V樣)÷T=90.09×ΔA÷W

3. 按細(xì)胞或細(xì)菌數(shù)量計(jì)算：

單位的定義：每10⁴個(gè)細(xì)胞或細(xì)菌每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位,。

酪氨酸酶（U/10⁴cell）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷(500÷V提取×V樣)÷T=0.18×ΔA

4. 按血清（漿）體積計(jì)算：

單位的定義：每mL血清（漿）每分鐘催化生成1nmol多巴色素的酶量定義為一個(gè)酶活性單位,。

酪氨酸酶（U/mL）=ΔA÷（ε×d）×V反總×10⁹÷V樣÷T=90.09×ΔA

V反總：反應(yīng)總體積，10^-3L,；ε：多巴色素的摩爾消光系數(shù)：3.7×10⁴L/mol/cm,；d：比色皿光徑，1cm,；10⁹： 單位換算系數(shù),，1mol=10⁹nmol；V樣：加入的樣本體積,，0.1mL,；Cpr：樣本蛋白濃度,，mg/mL；W：樣本質(zhì)量,，g,；V提取：提取液體積,，1mL,；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬,；T：反應(yīng)時(shí)間，3min,。

注意事項(xiàng)： 

1. 當(dāng)ΔA大于0.3時(shí),，建議將樣本用提取液稀釋后測(cè)量；ΔA過小時(shí),，建議增加酶促反應(yīng)時(shí)間（5min或10min）或增加加入的樣本體積來測(cè)定,。

2. 試劑一溶解后易氧化。溶解后盡快用完,。