谷胱甘肽 S-轉(zhuǎn)移酶（GST）活性檢測試劑盒（紫外分光光度法）

注意：正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定,。

產(chǎn)品貨號：BA1119

產(chǎn)品規(guī)格：50管/48樣

產(chǎn)品簡介：

GST是一種具有多種生理功能的蛋白質(zhì)家族,，主要存在于細(xì)胞質(zhì)內(nèi),。GST是體內(nèi)解毒酶系統(tǒng)的重要組成部分,，主要催化各種化學(xué)物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物與GSH的巰基共價(jià)結(jié)合,，使親電化合物變?yōu)橛H水物質(zhì),，易于從膽汁或尿液中排泄,，達(dá)到將體內(nèi)各種潛在或具備毒性的物質(zhì)降解并排出體外的目的,。因此，GST在保護(hù)細(xì)胞免受親電子化合物的損傷中發(fā)揮著重要的生物學(xué)功能,。此外,，因?yàn)?/span>GST具有GSH-Px活性，亦稱為non-Se GSH-Px,，具有修復(fù)氧化破壞的大分子如DNA,、蛋白質(zhì)等的功能。注意,，GST催化的反應(yīng)減少GSH含量,，但是不增加GSSG含量。

GST催化GSH與CDNB結(jié)合,，其結(jié)合產(chǎn)物的光吸收峰波長為340nm,；通過測定340nm波長處吸光度上升速率，即可計(jì)算出GST活性,。

產(chǎn)品內(nèi)容：

試劑一：液體50mL×1瓶,，4℃保存。

試劑二：液體45mL×1瓶,，4℃保存,。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存,。臨用前加5mL蒸餾水溶解,。

需自備的儀器和用品：

低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器,、紫外-可見分光光度計(jì)、1mL石英比色皿和蒸餾水,。

操作步驟：

一,、粗酶液提取：

1,、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織,，加入1mL試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,，4℃離心10min,，取上清置冰上待測。

2,、細(xì)菌,、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w,，超聲3秒,，間隔7秒，總時(shí)間3min）,；然后8000g,，4℃，離心10min,，取上清置于冰上待測,。

3、血清等液體：直接測定,。

二,、測定： 

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上,，調(diào)節(jié)波長到340nm,，用蒸餾水調(diào)零。

2,、試劑二放在25℃（一般物種）或者37℃（哺乳動物）保溫,。

3、空白管：取1mL石英比色皿,，加入100μL試劑一,，900μL試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定10s 吸光度記A1,，37℃水浴5min后,，快速取出測定吸光度記A2。

4,、測定管：取1mL石英比色皿,，加入100μL上清液,，900μL試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于340nm測定10s吸光度記A3,，37℃水浴5min后,，快速取出測定吸光度記A4。

三,、GST活性計(jì)算： 

（1）按蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每毫克蛋白每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個(gè)酶活性單位。

GST（U/mg prot）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷(Cpr×V樣)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每克樣品每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個(gè)酶活性單位,。

GST（U/g鮮重）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷(V樣÷V樣總×W)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷W

（3）按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中，每10⁴個(gè)細(xì)胞每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個(gè)酶活單位,。

GST（U/10⁴ cell）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷（ε×d）×10⁶×V反總÷(細(xì)胞數(shù)量×V樣÷V樣總)÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)] ÷細(xì)胞數(shù)量

（4）按液體體積計(jì)算

活性單位定義：在25℃或者37℃中,，每毫升液體每分鐘催化1μmol CDNB與GSH結(jié)合為一個(gè)酶活單位。

GST（U/mL）=[(A4－A3)－(A2-A1)]÷(ε×d)×10⁶×V反總÷V樣÷T

=0.23×[(A4－A3)－(A2-A1)]

ε：產(chǎn)物摩爾消光系數(shù),，9.6×10³ L/mol /cm,；d：比色皿光徑，1cm,；10⁶：1mol=1×10⁶μmol,；V反總：反應(yīng)體系總體積，1100μL=0.0011 L,；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度（mg/mL）,，需要另外測定，建議選用本公司生產(chǎn)的BCA蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒,；W ：樣品鮮量,，g；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積,，100μL=0.1 mL,；V樣總：試劑一體積，1mL,；T：反應(yīng)時(shí)間（min）,，5min。  

注意事項(xiàng)： 

1,、樣品處理等過程均需要在冰上進(jìn)行,，且須在當(dāng)日測定酶活力；

2,、細(xì)胞中GST活性測定時(shí),，細(xì)胞數(shù)目須在300萬-500萬之間，細(xì)胞中GST的提取時(shí)可加試劑一后研磨或超聲波處理，不能用細(xì)胞裂解液處理細(xì)胞,；

3,、測定前先用1～2個(gè)樣做預(yù)實(shí)驗(yàn)，如5min內(nèi)反應(yīng)不成線性,，須對樣品用蒸餾水稀釋,，計(jì)算結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)；

4,、若樣品測定吸光度大于1，建議對樣品用蒸餾水稀釋,，計(jì)算時(shí)結(jié)果乘以稀釋倍數(shù),；

5、測定反映的溫度對測定結(jié)果有影響,，請控制在25℃或者37℃（哺乳動物）,。