超濾離心管常用于做細胞培養(yǎng)上清的蛋白濃縮的實驗,，使用注意事項：
(1)選擇合適的超濾管。通常應截留分子量不應大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管,。認真閱讀使用說明書，注意超濾膜對各種化學物質(zhì)的耐受程度有所不同,。
(2)新買來的超濾是干燥的,，使用前加入超純水，水量*過膜,，冰浴或冰箱里預冷幾分鐘,。然后將水倒出,，即可加入蛋白液,，加入的多少，以不超過管頂?shù)陌拙€為準,。操作要輕,，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷,。
(3)平衡,。超濾離心管質(zhì)量和重心二者都要達到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜,。開始離心超濾(離心機預冷至4度)。不同離心機的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后,，有所不同,。離心機的加速度調(diào)至低檔，減小對膜的壓力,。注意,，一定要等離心機達到目的轉(zhuǎn)速之后，方可離開離心機,，否則離心機出問題時,，無法時間處理。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機的情況是膜與軸垂直)。在實際使用中,，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長離心管的使用壽命。
(4)當濃縮到剩下1ml時,，取50ul緩沖溶液,，加入10ul流穿，看有沒變藍色,，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾,。要精確判斷是否漏管,，用5mgml的BSA離心10min，再取流穿,，跑蛋白膠或Bradford粗測,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作，防止蛋白受熱),，直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀，導致堵管,。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時超濾,，的辦法解決,，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止,。
(5)前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候,，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),，再 濃縮至1ml左右，連續(xù)三次,，后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。超濾離心管按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的,。
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