超濾離心管常用于做細(xì)胞培養(yǎng)上清的蛋白濃縮的實(shí)驗(yàn),，使用注意事項(xiàng)：
(1)選擇合適的超濾管,。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書,，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,。
(2)新買來的超濾是干燥的，使用前加入超純水,，水量*過膜,，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,，即可加入蛋白液，加入的多少,，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn),。操作要輕，加入蛋白液前,，超濾管需要插在冰上預(yù)冷,。
(3)平衡。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡,。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾(離心機(jī)預(yù)冷至4度),。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后,，有所不同。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,，減小對(duì)膜的壓力,。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,，方可離開離心機(jī),，否則離心機(jī)出問題時(shí)，無法時(shí)間處理,。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直),。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。
(4)超濾離心管當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，取50ul緩沖溶液,，加入10ul流穿,，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾,。要精確判斷是否漏管，用5mgml的BSA離心10min,，再取流穿,，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,，防止蛋白受熱),，直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管,。若發(fā)生沉淀，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適,；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，的辦法解決,，后者的方法是換不同的緩沖溶液,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止。
(5)前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),，再 濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次，后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。超濾離心管按照每次至少10倍左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上,，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
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