1、選擇合適的超濾管,。通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa,，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管,。認(rèn)真閱讀使用說(shuō)明書(shū)，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,。
2,、新買來(lái)的超濾是干燥的，使用前加入超純水,，水量*過(guò)膜,，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘。然后將水倒出,，即可加入蛋白液,，加入的多少，以不超過(guò)管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn),。操作要輕,，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷,。
3,、直接損壞超濾膜。開(kāi)始離心超濾（離心機(jī)預(yù)冷至4度）,。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速rpm換算成g之后,，有所不同。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,，減小對(duì)膜的壓力,。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,，方可離開(kāi)離心機(jī),，否則離心機(jī)出問(wèn)題時(shí)，無(wú)法時(shí)間處理,。膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說(shuō)明書(shū)調(diào)整（角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直）,。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開(kāi)的比說(shuō)明書(shū)里的要低,，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。
4、當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí),，取50ul緩沖溶液,，加入10ul流穿，看有沒(méi)變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開(kāi)始超濾。要精確判斷是否漏管,，用5mgml的離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè),，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作,，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止,。離心過(guò)程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過(guò)高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時(shí)超濾,，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的緩沖溶液，直到蛋白不發(fā)生沉淀為止,。
5,、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候,，輕輕加入新的Buffer（經(jīng)0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次,，最后一次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況,。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達(dá)到1000倍以上,，基本上可以達(dá)到換buffer的目的,。
STEEMA超濾離心管（15ml）有超過(guò)7種不同的截留分子量(截留分子量,MWCO)：3Kda，5Kda,，10Kda,，30Kda,，50Kda,，100Kda，500Kda等,。
可選濾膜：再生纖維素（RC）,，聚醚砜（PES）,。
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