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超濾離心管使用的注意事項(xiàng)
超濾離心管使用的注意事項(xiàng)
離心管就是一個(gè)簡(jiǎn)單的可以承受高轉(zhuǎn)速壓力的管子,，比如離一些樣品,，分離出上清沉淀。 蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管,，目前常用的就是Millipore的。目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標(biāo)體積而定,。可重復(fù)使用,，使用一次就扔掉太浪費(fèi),。
離心超濾管會(huì)有一個(gè)類似于內(nèi)管和外管的兩個(gè)部分,，內(nèi)管中是帶有一定分子量的膜，當(dāng)高速離心時(shí),，分子量比它小的就漏到下面的管子(即外管)中了,，分子量比它大的就截留在上面(即內(nèi)管中)，就是超濾的原理,。超濾離心管的選擇主要看你要截留那部分物質(zhì),，就選擇比最小分子量小的，如果你要截留26KD的,，你要的超濾管就要比26小,。但兩者也要有一定的差距，比如,，選擇20-25KD之間的就不合適,，因?yàn)?6的也可能會(huì)出去(這是由制造工藝決定的)。所以選擇20KD以下的超濾管比較合適,。
以下是給大家總結(jié)的超濾離心管使用的注意事項(xiàng),。
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選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積,，常見的是10kD,。到底選擇多大截留分子量比較合適呢?10kDa、 5kDa,、還是30kDa?通常應(yīng)截留分子量不應(yīng)大于目的蛋白分子量的1/3,，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾 管,。若目的蛋白分子量為10kD左右,，則可以用截留分子量3kD的超濾管。認(rèn)真閱讀使用說明書,，注意超濾膜對(duì)各種化學(xué)物質(zhì)的耐受程度有所不同,，表格中有。
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新買來(lái)的超濾是干燥的,，使用前加入MilliQ水,，水量*過膜，冰浴或冰箱里預(yù)冷幾分鐘,。然后將水倒出,，即可加入蛋白液，加入的多少,，以不超過管頂?shù)陌拙€為準(zhǔn),。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預(yù)冷,。
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平衡,。質(zhì)量和重心二者都要達(dá)到平衡。注意轉(zhuǎn)速和加速度不可太快,，否則直接損壞超濾膜,。開始離心超濾(離心機(jī)預(yù)冷至4度)。不同離心機(jī)的轉(zhuǎn)速 rpm換算成g之后,，有所不同,。具體可參閱附件里的說明書。離心機(jī)的加速度調(diào)至低檔,，減小對(duì)膜的壓力,。注意，一定要等離心機(jī)達(dá)到目的轉(zhuǎn)速之后,，方可離開離心機(jī),，否則離心機(jī)出問題時(shí)，無(wú)法馬上處理,，后果不可預(yù)測(cè)!膜與轉(zhuǎn)軸的方向根據(jù)說明書調(diào)整(角轉(zhuǎn)離心機(jī)的情況是膜與軸垂直),。在實(shí)際使用中，一般轉(zhuǎn)速開的比說明書里的要低,，這樣可以延長(zhǎng)離心管的使用壽命,。
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當(dāng)濃縮到剩下1ml時(shí)，【取50ul國(guó)產(chǎn)Bradford溶液,，加入10ul流穿,，看有沒變藍(lán)色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白,。如果管漏了,，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管,，用5mg/ml的BSA離心10min,，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測(cè)】,，繼續(xù)加入剩下的蛋白液濃縮(在冰上操作,，防止蛋白受熱)，直到所有濃縮液都加完為止,。離心過程中注意是否發(fā)生蛋白沉淀,，導(dǎo)致堵管。若發(fā)生沉淀,，要確定沉淀的具體原因,，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適;前者可用多根超濾管同時(shí)超濾，降低濃度的辦法解決,，后者的方法是換不同的Buffer,，直到蛋白不發(fā)生沉淀為 止。
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前面幾步用以濃縮蛋白,，如果要換Buffer,，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時(shí)候，輕輕加入新的Buffer(經(jīng)0.22um超濾膜超濾),，再 濃縮至1ml左右,，連續(xù)三次，末次的濃縮終體積根據(jù)需要的蛋白濃度而定,，一般不多于500ul,，也有濃縮至200ul以內(nèi)的情況。按照每次至少10倍 左右的體積濃縮算,，三次達(dá)到1000倍以上,，基本上可以達(dá)到換buffer的目的。
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取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作,，用黃槍頭(200ul)取,，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打,、混勻蛋白液,，注意不要碰到超濾膜，然后吸取濃縮液,，每次吸接近200ul,，直到吸完。管底剩下的一點(diǎn)濃縮液不必吸取,，否則難度太大,，有可能損壞超濾膜。最后加入MilliQ水到超濾管中,，沒過 超濾膜,，防止膜失水變干。
以下是處理超濾管,，重復(fù)利用超濾管的步驟,。
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倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤(rùn)洗幾次,，【若管底有可見的蛋白沉淀,，可以先加入水，然后用槍頭吹打,，注意不要碰到膜,，吹打至沉淀懸起,，然后倒掉，不可用自來(lái)水猛沖】然后加入0.2M的NaOH溶液,，室溫放置20min,，期間平衡超濾管。再離心10min,。倒出殘留的NaOH溶液,，將 管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個(gè)小時(shí),再換新的水,放置幾個(gè)小時(shí)，不斷稀釋NaOH濃度,。50ml管和蓋子用自來(lái)水洗,，內(nèi)壁再用 MilliQ水洗干凈。
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取出浸沒的管芯,，加至接近滿的MilliQ水,，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml離心管,，排出部分水,，然后蓋上蓋子，放4度保存,，直到下次使用,。一般來(lái)說，按照上述步驟和注意事項(xiàng),，每根管用三四年不會(huì)壞,。
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