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共聚焦成像——如何讓細(xì)胞在玻璃底培養(yǎng)皿更好地貼壁

閱讀：3246 發(fā)布時間：2021-7-1

共聚焦成像——如何讓細(xì)胞在玻璃底培養(yǎng)皿更好地貼壁

很多童鞋做共聚焦成像的時候都會遇到細(xì)胞貼壁難的問題。今天分享下如何處理玻璃底培養(yǎng)皿,、如何選擇玻璃底培養(yǎng)皿,，讓細(xì)胞妥妥地貼壁，大家做共聚焦時候能夠更得心應(yīng)手,。

市面上常見的玻璃底培養(yǎng)皿,，通常是在塑料培養(yǎng)皿底部打個洞，再將厚度為170-220μm的蓋玻片或細(xì)胞爬片用無影膠水或硅膠粘于培養(yǎng)皿底部,。并不是整個培養(yǎng)皿的底部都是玻璃材質(zhì)的,。適用于觀測的區(qū)域僅僅在打孔的區(qū)域。但是由于玻璃的疏水性,，往往在培養(yǎng)細(xì)胞的時候,，細(xì)胞不能在玻璃上很好地貼壁，生長狀態(tài)并不好,，甚至在做共聚焦掃描成像的時候發(fā)生細(xì)胞脫片的現(xiàn)象,。

圖1 市面常見玻璃底培養(yǎng)皿

想要細(xì)胞好好貼壁，所使用的玻璃底培養(yǎng)皿進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)之前,，要確認(rèn)已經(jīng)包被了特定的蛋白試劑,。

自己動手包被

培養(yǎng)不同的細(xì)胞，需要的包被試劑也不同。同時,，因?yàn)?/span>用于包被的蛋白是生物產(chǎn)物,，所以不同公司的包被蛋白的產(chǎn)品純度和用量都是不同的，本技術(shù)帖只是提供參考,，具體的包被試劑用量還是要參考所用品牌的說明書,。并且最好以自己所用的試劑先做一個梯度實(shí)驗(yàn)，找出適合的包被濃度,。

這里以 Poly-L-Lysine 為例（PLL,，sigma,，P4832, 100μg/ml）：

PLL包被適用于絕大多數(shù)細(xì)胞,，尤其適用于中樞系統(tǒng)神經(jīng)元的培養(yǎng)。在使用時需要使單位面積上的蛋白含量（μg/cm2）達(dá)到理想的量,。本例中PLL推薦包被的用量為 2μg/cm2,。需要根據(jù)包被面積，包被體積,，來計(jì)算所需要蛋白質(zhì)的量,。

比如：35mm玻璃底培養(yǎng)皿，細(xì)胞生長面積是3.5cm2,，包被面積是4.1cm2,，包被液體積是400μl，那根據(jù)推薦用量2μg/cm2,。那么單孔中需要8.2μg的PLL,，如果只加入400μl的PLL溶液，那PLL的溶液濃度為20.5μg/ml（約為 20μg/ml）,。所以,，需要用超純水將原液進(jìn)行稀釋。

具體步驟：

1.使用超純水按照1:5稀釋PLL原液,。

2.在每個35mm玻璃底培養(yǎng)皿中加入400μl的PLL稀釋液,。

3.室溫孵育1-2小時，吸出PLL稀釋液,。

4.使用2ml PBS溶液或無血清培養(yǎng)基小心的清洗3次,，吸盡清洗液。

5.直接加入細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng),。

方法評價

由于各種包被蛋白的性質(zhì)不同,，不同的包被蛋白使用方法也不一樣。經(jīng)常由于需要對玻璃底培養(yǎng)皿包被,，而產(chǎn)生了新的污染,。而且污染往往是開始養(yǎng)細(xì)胞了以后才會發(fā)現(xiàn)，這樣不僅耽誤了時間，而且也浪費(fèi)了試劑盒耗材,。畢竟包被蛋白試劑和質(zhì)量有保證的玻璃底培養(yǎng)皿價格也是不菲的（質(zhì)量不過關(guān)的玻璃底培養(yǎng)皿有可能會因?yàn)槟z水沒有粘勻而漏液或者使用的膠水對細(xì)胞有毒性）,。

無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿

對于想節(jié)省時間和功夫的童鞋，還是直接使用無需包被的共聚焦培養(yǎng)皿更為方便些,。

選擇合適的培養(yǎng)皿需要考慮的因素有：是否適合自己的細(xì)胞貼壁,、培養(yǎng)皿的光學(xué)特性是否符合共聚焦要求。

能符合上述因素要求的培養(yǎng)皿,，不局限于帶包被的玻璃底培養(yǎng)皿,，事實(shí)上，大家都知道塑料培養(yǎng)皿更便宜,、相對玻璃來說,，也更容易讓細(xì)胞貼壁。這里以德國ibidi的共聚焦培養(yǎng)皿為例,，說一下符合共聚焦實(shí)驗(yàn)的培養(yǎng)皿需要具備哪些參數(shù)：

圖2 德國ibidi共聚焦培養(yǎng)皿和高質(zhì)量玻璃底培養(yǎng)皿的底部參數(shù)對比

可以看出,，符合直接使用要求的共聚焦培養(yǎng)皿，它們的物理參數(shù)都是非常接近玻璃的,，但同時,，它們又還具有親水的特性，能讓大多數(shù)細(xì)胞更好貼壁,；而且透氣性和延展性都要比玻璃更好,。比如這里舉例的ibidi培養(yǎng)皿，就可讓絕大多數(shù)細(xì)胞系和原代細(xì)胞直接貼壁生長,，而且不易碎,，算是不錯的選擇。

大家也可根據(jù)自己具體實(shí)驗(yàn)要求,，結(jié)合上述表格的參數(shù),，找到最合適自己實(shí)驗(yàn)的共聚焦培養(yǎng)皿。

方法評價

選擇這類培養(yǎng)皿,，不需要額外包被,，大大減少了污染的風(fēng)險,。并且由于塑料底部比較易于加工,，不需要膠水就能使其固定在培養(yǎng)皿底部。杜絕了漏液或者細(xì)胞毒性的可能,。

高通量共聚焦實(shí)驗(yàn)耗材

由于單個培養(yǎng)皿通量很小,，如果一次要做多個樣品，操作就會比較麻煩,，且試劑用量會較大,，這時候可以選擇多孔的耗材，比如腔室載玻片（2/4/8孔），可以滿足研究人員需要一次進(jìn)行多通量的成像,。并且相對于傳統(tǒng)的共聚焦培養(yǎng)皿,，腔室載玻片需要試劑的更少，非常節(jié)約價格昂貴的抗體,，單孔實(shí)驗(yàn)的成本大大降低,。