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大規(guī)模培養(yǎng)常用方法(貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)與固定化培養(yǎng))

閱讀:2839        發(fā)布時間:2021-6-28

大規(guī)模培養(yǎng)常用方法(貼壁培養(yǎng)、懸浮培養(yǎng)與固定化培養(yǎng))

 

根據(jù)動物細(xì)胞的類型,,可采用貼壁培養(yǎng),、懸浮培養(yǎng)和固定化培養(yǎng)等三種培養(yǎng)方法進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。

一,、動物細(xì)胞生長特性及培養(yǎng)溫度

1. 細(xì)胞生長緩慢,,易污染,培養(yǎng)需用抗生素
2.細(xì)胞大,,無細(xì)胞壁,,機(jī)械強(qiáng)度低,環(huán)境適應(yīng)性差
3.需氧少,,不耐受強(qiáng)力通風(fēng)與攪拌
4. 群體生長效應(yīng),,貼壁生長(錨地依賴性)
5.培養(yǎng)過程產(chǎn)品分布細(xì)胞內(nèi)外,成本高
6.原代培養(yǎng)細(xì)胞一般繁殖50代即退化死亡

依據(jù)在體外培養(yǎng)時對生長基質(zhì)依賴性差異,,動物細(xì)胞可分為兩類:

●貼壁依賴型細(xì)胞:需要附著于帶適量電荷的固體或半固體表面才能生長,,大多數(shù)動物細(xì)胞,包括非淋巴組織細(xì)胞和許多異倍體細(xì)胞均屬于這一類,。

●非貼壁依賴型細(xì)胞:無需附著于固相表面即可生長,,包括血液、淋巴組織細(xì)胞,、許多腫瘤細(xì)胞及某些轉(zhuǎn)化細(xì)胞,。
培養(yǎng)細(xì)胞的最適溫度相當(dāng)于各種細(xì)胞或組織取材機(jī)體的正常溫度。人和哺乳動物細(xì)胞培養(yǎng)的最適溫度為 35~37℃,。偏離這一溫度,,細(xì)胞正常的代謝和生長將會受到影響,甚至死亡,??偟膩碚f,培養(yǎng)細(xì)胞對低溫的耐力比高溫高,。溫度不超過39℃時,,細(xì)胞代謝強(qiáng)度與溫度成正比;細(xì)胞培養(yǎng)置于39~40℃環(huán)境中1h,,即受到一定損傷,,但仍能恢復(fù);當(dāng)溫度達(dá)43℃以上時,,許多細(xì)胞將死亡,。當(dāng)溫度下降到30~20℃時,細(xì)胞代謝降低,,因而與培養(yǎng)基之間物質(zhì)交換減少,。首先看到的是細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變以及細(xì)胞從基質(zhì)上脫落下來,。當(dāng)培養(yǎng)物恢復(fù)到初始的培養(yǎng)溫度時,它們原有的形態(tài)和代謝也隨之恢復(fù)到原有水平,。

二,、貼壁培養(yǎng)(attachment culture)是指細(xì)胞貼附在一定的固相表面進(jìn)行的培養(yǎng)。

1. 生長特性:貼壁依賴型細(xì)胞在培養(yǎng)時要貼附于培養(yǎng)(瓶)器皿壁上,,細(xì)胞一經(jīng)貼壁就迅速鋪展,,然后開始有絲分裂,并很快進(jìn)入對數(shù)生長期,。一般數(shù)天后就鋪滿培養(yǎng)表面,,并形成致密的細(xì)胞單層。

2.貼壁培養(yǎng)的優(yōu)點:
●容易更換培養(yǎng)液,;細(xì)胞緊密黏附于固相表面,,可直接傾去舊培養(yǎng)液,清洗后直接加入新培養(yǎng)液,。
●容易采用灌注培養(yǎng),,從而達(dá)到提高細(xì)胞密度的目的;因細(xì)胞固定表面,,不需過濾系統(tǒng),。
●當(dāng)細(xì)胞貼壁于生長基質(zhì)時,很多細(xì)胞將更有效的表達(dá)一種產(chǎn)品,。
●同一設(shè)備可采用不同的培養(yǎng)液/細(xì)胞的比例,。
●適用于所有類型細(xì)胞。

3. 貼壁培養(yǎng)的缺點:與懸浮培養(yǎng)法相比
●擴(kuò)大培養(yǎng)比較困難,,投資大,;
●占地面積大;
●不能有效監(jiān)測細(xì)胞的生長,;

4.細(xì)胞貼壁的表面:要求具有凈陽電荷和高度表面活性,。對微載體而言還要求具一定電荷密度;若為有機(jī)物表面,,必須具有親水性,,并帶陽電荷。

5. 貼壁培養(yǎng)系統(tǒng):主要有轉(zhuǎn)瓶,、中空纖維(后面專題介紹),、玻璃珠、微載體系統(tǒng)(后面介紹)等,。

●轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng):培養(yǎng)貼壁依賴型細(xì)胞最初采用轉(zhuǎn)瓶系統(tǒng)培養(yǎng),。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)一般用于小量培養(yǎng)到大規(guī)模培養(yǎng)的過渡階段,或作為生物反應(yīng)器接種細(xì)胞準(zhǔn)備的一條途徑,。細(xì)胞接種在旋轉(zhuǎn)的圓筒形培養(yǎng)器-轉(zhuǎn)瓶中,,培養(yǎng)過程中轉(zhuǎn)瓶不斷旋轉(zhuǎn),,使細(xì)胞交替接觸培養(yǎng)液和空氣,從而提供較好的傳質(zhì)和傳熱條件,。

轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)具有結(jié)構(gòu)簡單,,投資少,技術(shù)成熟,,重復(fù)性好,放大只需簡單的增加轉(zhuǎn)瓶數(shù)量等優(yōu)點,。

但也有其缺點:勞動強(qiáng)度大,,占地空間大,單位體積提供細(xì)胞生長的表面積小,,細(xì)胞生長密度低,,培養(yǎng)時監(jiān)測和控制環(huán)境條件受到限制等。

現(xiàn)在使用的轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)系統(tǒng)包括二氧化碳培養(yǎng)箱和轉(zhuǎn)瓶機(jī)兩類,。

●反應(yīng)器貼壁培養(yǎng) 此種培養(yǎng)方式中,,細(xì)胞貼附于固定的表面生長,不因為攪拌而跟隨培養(yǎng)液一起流動,,因此比較容易更換培養(yǎng)液,,不需要特殊的分離細(xì)胞和培養(yǎng)液的設(shè)備,可以采用灌流培養(yǎng)獲得高細(xì)胞密度,,能有效地獲得一種產(chǎn)品,;但擴(kuò)大規(guī)模較難,不能直接監(jiān)控細(xì)胞的生長情況,,故多用于制備用量較小,、價值高的生物藥品。

大規(guī)模培養(yǎng)常用方法(貼壁培養(yǎng),、懸浮培養(yǎng)與固定化培養(yǎng))

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