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檢測微生物檢測方法和操作步驟
產(chǎn)品采集與樣品處理
于同一批 號的 二個運輸包裝中至少抽取 12個蕞小銷售包裝樣品,，1/4樣品用于檢測,，1/4樣品用于留樣,，另 1/2樣品（可就地封存）必要時用于復(fù)檢,。抽樣的蕞小銷售包裝不應(yīng)有破裂,，檢驗前不得啟開,。
在100級凈化條件下用無菌方法打開用于檢測的至少 3個包裝，從每個包裝中取樣,，準(zhǔn)確稱取10g±1g樣品,。剪碎后加人到200ml滅菌生理鹽水中，充分混勻,，得到一個生理鹽水樣液,。液體產(chǎn)品用原液直接做樣液。
如被檢樣品含有大量吸水樹脂材料而導(dǎo)致不能吸出足夠樣液時,，稀釋液量可按每次 50ml遞增,，直至能吸出足夠測試用樣液。在計算細(xì)菌菌落總數(shù)與真菌菌落總數(shù)時相應(yīng)調(diào)整稀釋度,。
B2 細(xì)菌菌落總數(shù)與初始污染菌檢測方法
本方法適用于產(chǎn)品初始污染菌與細(xì)菌菌落總數(shù)（以下統(tǒng)稱為細(xì)菌菌落總數(shù)）檢測,。
B2.1 操作步驟
待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作菌落計數(shù)。共接種 5個平皿,，每個平皿中加人 1ml樣液,，然后用冷卻至45℃左右的熔化的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基 15～20ml倒人每個平皿內(nèi)混合均勻 。待瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置 35℃±2℃培養(yǎng) 48h后,，計算平板上的菌落數(shù),。
B2.2 結(jié)果報告
菌落呈片狀生長的平板不宜采用；計數(shù)符合要求的平板上的菌落,，按式（B1）計算結(jié)果：
X1=A×（K÷5）
式中X1—–細(xì)菌菌落總數(shù) cfu/g或cfu/mL,；
A——5塊營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上的細(xì)菌菌落總數(shù)；
K——稀釋度,。
當(dāng)菌落數(shù)在 100以內(nèi)，按實有數(shù)報告,，大于 100時采用二位有效數(shù)字,。
如果樣品菌落總數(shù)超過本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，按 B2.3進行復(fù)檢和結(jié)果報告,。
B2.3 復(fù)檢方法
將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測 2次,，2次結(jié)果平均值都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定，則判定被檢樣品合格；其中有任何 1次結(jié)果平均值超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,，則判定被檢樣品不合格,。
B3 大腸菌群檢測方法
B3.1 操作步驟
取樣液 5ml接種 50ml，乳糖膽鹽發(fā)酵管,，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h,，如不產(chǎn)酸也不產(chǎn)氣，則報告為大腸菌群陰性,。
如產(chǎn)酸產(chǎn)氣,，則劃線接種伊紅美藍(lán)瓊脂平板，置35℃±2℃培養(yǎng) 18～24h,，觀察平板上菌落形態(tài),。典型的大腸菌落為黑紫色或紅紫色，圓形,，邊緣整齊,，表面光滑濕潤，常具有金屬光澤,，也有的呈紫黑色,，不帶或略帶金屬光澤，或粉紅色,，中心較深的菌落,。
取疑似菌落 1-2個作革蘭氏染色鏡檢，同時接種乳糖發(fā)醉管,，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h,，觀察產(chǎn)氣情況。
B3.2 結(jié)果報告
凡乳糖膽鹽發(fā)酵骨產(chǎn)酸產(chǎn)氣,，乳糖發(fā)酵管產(chǎn)酸產(chǎn)氣,，在伊紅美藍(lán)平板上有典型大腸菌落，革蘭氏染色為陰性無芽胞桿菌,，可報告被檢樣品檢出大腸桿菌,。
B4 綠膿桿菌檢測方法
B4.1 操作步驟
取樣液 5ml，加人到50ml SCDLP培養(yǎng)液中,，充分混勻,，置 35℃±2℃培養(yǎng) 18～24h。如有綠膿桿菌生長,，培養(yǎng)液農(nóng)面呈現(xiàn)一層薄菌膜,，培養(yǎng)液常呈黃綠色或藍(lán)綠色。從培養(yǎng)液的薄菌膜處挑取培養(yǎng)物,，劃線接種十六烷*基溴化胺瓊脂平板,，置 35℃±2℃ 培養(yǎng) 18～24h,，觀察菌落特征。綠膿桿菌在此培養(yǎng)基上生長良好,，菌落扁平,，邊緣不整，菌落周圍培養(yǎng)基略帶粉紅色,，其他菌不長,。
取可疑菌落涂片作革蘭氏染色，鏡檢為革蘭氏陰性菌者應(yīng)進行下列試驗：
氧化酶試驗：取一小塊潔凈的白色濾紙片放在滅菌平皿內(nèi),，用無菌玻棒挑取可疑菌落涂在濾紙片上,，然后在其上滴加一滴新配制的 1%二甲基對苯二胺試液，30s內(nèi)出現(xiàn)粉紅色或紫紅色,，為氧化酶試驗陽性,，不變色者為陰性。
綠膿菌素試驗：取2-3個可疑菌落,，分別接種在綠膿菌素測定用培養(yǎng)基斜面,，35℃±2℃培養(yǎng)24h，加入 3～5ml,，充分振蕩使培養(yǎng)物中可能存在的綠膿菌素溶解,，待三-氯-甲-烷呈藍(lán)色時，用吸管移到另一試管中并加人 1mol/L的鹽酸1mL,，振蕩后靜置片刻,。如上層出現(xiàn)粉紅色或紫紅色即為陽性，表示有綠膿菌素存在,。
硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗：挑取被檢菌落純培養(yǎng)物接種在硝酸鹽脈水培養(yǎng)基中,，置 35C12C培養(yǎng)24h培養(yǎng)基小倒管中有氣者即為陽性
明膠液化試驗:取可疑菌落純培養(yǎng)物，穿刺接種在明膠培養(yǎng)基內(nèi),，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h,，取出放于4～10C，如仍呈液態(tài)為陽性,，凝固者為陰性,。
42℃生長試驗：取可疑培養(yǎng)物，接種在普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上,，置 42℃培養(yǎng) 24～48h,，有綠膿桿菌生長為陽性。
B4.2 結(jié)果報告
被檢樣品經(jīng)增菌分離培養(yǎng)后,，證實為革蘭氏陰性桿菌,，氧化酶及綠膿桿菌試驗均為陽性者，即可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌 如綠膿菌素試驗陰性而液化明膠,、硝酸鹽還原產(chǎn)氣和42℃生長試驗三者皆為陽性時,，仍可報告被檢樣品中檢出綠膿桿菌。
B5 金黃色葡萄球菌檢測方法
B5.1 操作步驟
取樣液 5ml,，加入到 50mL SCDLP培養(yǎng)液中,，充分混勻，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h,，自上述增菌液中取1～2接種環(huán),，劃線接種在血瓊脂培養(yǎng)基上，置 35℃±2℃培養(yǎng)24～48h,。在血瓊脂平板上該菌菌落呈金黃色,，大而突起，圓形,，不透明,，表面光滑，周圍有溶血圈,。
挑取典型菌落,，涂片作革蘭氏染色鏡檢，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽性球菌,，排列成葡萄狀,，無芽胞與莢膜。鏡檢符合 上述情況,，應(yīng)進行下列試驗：
甘露醇發(fā)酵試驗：取上述菌落接種甘露醇培養(yǎng)液,，置 35℃±2℃培養(yǎng) 24h，發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸者為陽性,。
血漿凝固酶試驗：（1）玻片法：取清潔干燥載玻片,，一端滴加一滴生理鹽水，另一端滴加一滴兔血漿,，挑:取菌落分別與生理鹽水和血漿混合,，5min如血漿內(nèi)出現(xiàn)團塊或顆粒狀凝塊，而鹽水滴仍呈均勻混濁無凝固則為陽性,，如兩者均無凝固則為陰性,。凡鹽水滴與血漿滴均有凝固現(xiàn)象，再進行試管凝固酶試驗,；（2）試管法：吸取 1：4新鮮血漿 0.5ml,，放滅菌小試管中，加入等量待檢菌 24hrou湯培養(yǎng)物 0.55mL,，混勻,，放 35℃±2℃溫箱或水浴中，每半小時觀察一次,，24h之內(nèi)呈現(xiàn)凝塊即為陽性,。同時以已知血漿凝固酶陽性和陰性菌株湯培養(yǎng)物各0.5ml,，作為陽性與陰性對照。
B5.2 結(jié)果報告
凡在瓊脂平板上有可疑菌落生長,，鏡檢為革蘭氏陽性葡萄球菌,，并能發(fā)酵甘露醇產(chǎn)酸，血漿凝固酶試驗陽性者,，可報告被檢樣品檢出金黃色葡萄球菌,。
B6 溶血性鏈球菌檢測方法
B6.1 操作步驟
取樣液 5ml加人到 50ml葡萄糖ROU湯， 35℃±2℃培養(yǎng) 24h,，將培養(yǎng)物劃線接種血瓊脂平板,， 35℃±2℃培養(yǎng)24h觀察菌落特征。溶血性鏈球菌在血平板上為灰自色,，半透明或不透明,，針尖狀突起，表面光滑,，邊緣整齊,，周圍有無色透明溶血圈。
挑取典型菌落作涂片革蘭氏染色鏡檢,，應(yīng)為革蘭氏陽性,，呈鏈狀排列的球菌。鏡檢符合上述情況,，應(yīng)進行下列試驗：
鏈激酶試驗：吸取草酸鉀血漿 0.2ml（0.01g草酸鉀加5mL兔血漿混勻,，經(jīng)離心沉淀，吸取上清液）,，加人 0.8ml滅菌生理鹽水,，混勻后再加人待檢菌 24h rou湯培養(yǎng)物0.5ml和0.25%氯化鈣0.25ml，混勻,，放 35℃±2℃水浴中,，2min觀察一次（一般10min內(nèi)可凝固），待血漿凝固后繼續(xù)觀察并記錄溶化時間,。如 2h內(nèi)不溶化,，繼續(xù)放置 24h觀察，如凝塊全部溶化為陽性,，24h仍不溶化為陰性,。
桿菌膚敏感試驗：將被檢菌菌液涂于血平板上，用滅菌鑷子取每片含 0.04單位桿菌膚的紙片放在平板表面仁,，同時以已知陽性菌株作對照,，在 35℃±2℃下放置 18～24h，有抑菌帶者為陽性,。
B6.2 結(jié)果報告
鏡檢革蘭氏陽性鏈狀排列球菌,，血平板上呈現(xiàn)溶血圈,，鏈激酶和桿菌膚試驗陽性，可報告被檢樣品檢出溶血性鏈球菌,。
B7 真菌菌落總數(shù)檢測方法
B7.1 操作步驟
待上述生理鹽水樣液自然沉降后取上清液作真菌計數(shù),。共接種5個平皿，每個平皿中加人 1ml樣液,，然后用冷卻至 45℃左右的熔化的沙氏瓊脂培養(yǎng)基 15 ～25mL倒人每個平皿內(nèi)混合均勻，瓊脂凝固后翻轉(zhuǎn)平皿置 25℃±2℃培養(yǎng) 7天,，分別于 3,，5，7天觀察,，計算平板上的菌落數(shù),，如果發(fā)現(xiàn)菌落蔓延，以前 一次的菌落計數(shù)為準(zhǔn),。
B7.2 結(jié)果報告
菌落呈片狀生長的平板不宜采用,；計數(shù)符合要求的平板上的菌落，按式（B2）計算結(jié)果：
X2=B×（K÷5）
式中X2—–真菌菌落總數(shù),，cfu/g或cfu/mL,；
B—–5塊沙氏瓊脂培養(yǎng)基平板上的真菌菌落總數(shù);
K—–稀釋度。
當(dāng)菌落數(shù)在 100以內(nèi),，按實有數(shù)報告,，大于 100時采用二位有效數(shù)字。
如果樣品菌落總數(shù)超過本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,，按 B7.3進行復(fù)檢和結(jié)果報告,。
B7.3 復(fù)檢方法
將留存的復(fù)檢樣品依前法復(fù)測 2次，2次結(jié)果都達(dá)到本標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定,，則判定被檢樣品合格,；其中有任何 1次結(jié)果超過本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，則判定被檢樣品不合格,。
B8 真菌定性檢測方法
B8.1 操作步驟
取樣液 5mL加入到50mL沙氏培養(yǎng)基中,， 25℃±2℃培養(yǎng) 7天，逐日觀察有無真菌生長,。
B8.2 結(jié)果報告
培養(yǎng)管混濁應(yīng)轉(zhuǎn)種沙氏瓊脂培養(yǎng)基,，證實有真菌生長，可報告被檢樣品檢出真菌,。