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　　凍存管的使用是一門學(xué)問，并不是打開液氮罐,、放入凍存管、關(guān)上液氮罐這樣簡單的三部曲可以完成的,。科學(xué)正確地使用凍存管,，可以避免樣本的損失，并保護試驗人員的安全,。

　　01細胞凍存流程

　　1,、用預(yù)熱過的 PBS 對細胞進行沖洗，棄去 PBS 后,，加入含 EDTA 的胰酶消化液對細胞進行消化(消化液薄薄地覆蓋細胞表面即可,，消化液濃度須根據(jù)不同的細胞系進行調(diào)整),。

　　2,、37℃消化細胞 3–5 分鐘,，不可過度消化,。

　　3、一旦細胞從底部脫離,，即可用含血清培養(yǎng)基終止消化，并用吸管輕輕吹打以重懸細胞,。

　　4、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液以沉淀細胞,，棄上清,，用含血清培養(yǎng)基對細胞沉淀進行重懸。

　　5,、對細胞進行計數(shù)(推薦 Neubauer chamber),。

　　6、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液,，棄上清。用適當(dāng)體積含血清培養(yǎng)基重懸細胞,。

　　7,、將細胞重懸液以 1:1 比例與凍存液(60% 培養(yǎng)基,，20% FCS,，20% DMSO) 進行混合后轉(zhuǎn)移至 Cryo.sTM 凍存管中,。凍存管中細胞的濃度應(yīng)為 1–5 ×10^6細胞/ml,。

　　8、含有細胞的凍存管須按照 −1 K/min 的冷卻速率進行冷凍,。將凍存管插在含異丙醇的凍存盒小室并放置在−70℃的冰箱中可以實現(xiàn)上述要求,。如果 凍存液中含有其他類型的樣品時,，則需要將 Cryo.s 凍存管在−20℃,，−70℃或者液氮的氣相層進行直接凍存。為確保每個樣品的均一凍存效 果,，4 ml 和 5 ml 的 Cryo.s凍存管需在−20℃過夜凍存后再轉(zhuǎn)移至 70℃或者液氮的氣相層,。

　　9,、然后將 Cryo.s 凍存管轉(zhuǎn)移至液氮罐,。為避免污染(例如支原體)并考慮到安全預(yù)防規(guī)范的要求,，建議將 Cryo.s 凍存管放置在液氮上方的氣相層而非液氮層,。

　　02細胞復(fù)蘇流程

　　1,、從液氮罐中取出凍存管后立即將其置于 37℃水浴中進行解凍，解凍時間約 1–2min,，解凍時需要不停搖動凍存管令其盡快融化,。此步解凍過程越快越好。

　　2,、將解凍好的細胞懸液轉(zhuǎn)移到 15 ml 離心管，并立即添加一定量含血清培養(yǎng)基進行混合,。

　　3、離心(500 × g, 5 min)細胞重懸液,，棄去上清,。用適當(dāng)體積的含血清培養(yǎng)基對細胞沉淀進行重懸后分裝到 1 個或多個細胞培養(yǎng)瓶中。

　　4,、請遵循細胞接種時的推薦濃度進行培養(yǎng),。

　　5、接下來的 12 個小時細胞需要靜置培養(yǎng),。

　　6,、細胞換液可在 24–48h 后進行。