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穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建
閱讀：1136 發(fā)布時(shí)間：2021-3-1穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系（穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株）指在細(xì)胞中持續(xù)穩(wěn)定表達(dá)特定基因或干擾特定基因表達(dá),。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的目的基因質(zhì)粒DNA整合到細(xì)胞染色體上，使細(xì)胞長(zhǎng)期穩(wěn)定表達(dá)該基因,。穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株包括多克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株和單克隆穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,。慢病毒感染目的細(xì)胞后，通過(guò)抗性基因篩選得到的細(xì)胞株是多個(gè)細(xì)胞克隆的組合,。單克隆細(xì)胞株是從多克隆細(xì)胞中經(jīng)細(xì)胞克隆挑選得到的,，由一個(gè)細(xì)胞擴(kuò)增得到的細(xì)胞株。單克隆細(xì)胞株性狀統(tǒng)一,，傳代過(guò)程中細(xì)胞的基因表達(dá)保持穩(wěn)定,。
用轉(zhuǎn)染質(zhì)?；虿《厩秩镜姆椒▽?gòu)建好的含靶基因的載體導(dǎo)入細(xì)胞，根據(jù)不同的基因載體中所含的抗性標(biāo)志選用相應(yīng)的藥物進(jìn)行篩選混合陽(yáng)性克隆,。在陽(yáng)性混合克隆的基礎(chǔ)上,，得到單細(xì)胞長(zhǎng)出的陽(yáng)性單克隆，繼而得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株,。常用的真核表達(dá)載體的抗性標(biāo)志物有嘌呤霉素（puromycin）,、潮霉素（hygromycin）和新霉素（neomycin）。
篩選穩(wěn)定細(xì)胞株的兩種方法
1,、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,，單克隆方法篩選穩(wěn)定細(xì)胞系
對(duì)大多數(shù)細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較低。對(duì)于基因過(guò)表達(dá),，如果轉(zhuǎn)染效率達(dá)到40%,，基因過(guò)表達(dá)尚可。但是對(duì)于基因干擾實(shí)驗(yàn),，對(duì)轉(zhuǎn)染效率要求遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于基因過(guò)表達(dá),，通常質(zhì)粒轉(zhuǎn)染無(wú)法滿足。
另外,，質(zhì)粒游離于細(xì)胞質(zhì)中,，很快降解，無(wú)法滿足較長(zhǎng)時(shí)間的檢測(cè)項(xiàng)目,；質(zhì)粒轉(zhuǎn)染整合幾率極低,，穩(wěn)定細(xì)胞株構(gòu)建耗時(shí)耗力，且得率很低,，往往需要挑取單克隆株,。
2、病毒感染篩選穩(wěn)定細(xì)胞株
病毒感染方法較質(zhì)粒轉(zhuǎn)染篩選單克隆方法更方便和高效,，是目前主流的穩(wěn)定細(xì)胞系篩選方法,。用慢病毒制備穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，由于其高效整合,、高效轉(zhuǎn)錄,、高效表達(dá)、宿主范圍廣,，感染效率高,，且與細(xì)胞染色體整合而不發(fā)生基因重排，是制備穩(wěn)定細(xì)胞株的理想載體,。
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株服務(wù)流程
1,、載體構(gòu)建：將外源基因構(gòu)建到合適的載體上，如需病毒轉(zhuǎn)染,，則包裝病毒,。
2,、篩選濃度測(cè)定：以 10-14 天細(xì)胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度。
3,、細(xì)胞接種：轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)前天接種細(xì)胞,，各種細(xì)胞的平板密度依據(jù)各種細(xì)胞的生長(zhǎng)率和細(xì)胞形狀而定。進(jìn)行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細(xì)胞應(yīng)達(dá)到 60%-80% 覆蓋,。
4,、細(xì)胞轉(zhuǎn)染：用構(gòu)建好的載體（或包裝好的病毒）轉(zhuǎn)染目的細(xì)胞。
5,、抗生素篩選,。
6、鑒定篩選結(jié)果,。
終交付
1,、病毒滴度檢測(cè)報(bào)告；穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株,；
2,、結(jié)題報(bào)告，包括詳細(xì)的實(shí)驗(yàn)流程,，測(cè)序結(jié)果和峰圖,、引物序列、載體圖譜和滴度測(cè)定報(bào)告和q-P