相對定量分析方法  ：
 2-ΔΔCt
染料法熒光定量PCR試劑盒前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100％且偏差在5％以內(nèi)
  1,、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值：
    ΔCT（test）= CT（target,test）-CT（ref,test） 
    ΔCT（calibrator）= CT（target,calibrator）-CT（ref, calibrator） 
  2,、用校準(zhǔn)樣本的ΔCT值歸一試驗樣本的ΔCT值：
         ΔΔCT= ΔCT（test） - ΔCT（calibrator）
  3、計算表達(dá)水平比率：
                    2 –ΔΔCT=表達(dá)量的比值

一,、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高,，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原,，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 段作為陽性對照,。
2. 標(biāo)記 6 個離心管,，分別為 7，6，5,，4,，3，2,。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 模板稀釋液（用帶芯槍頭,，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照,，充分震蕩 1 分鐘，得1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用,。
5. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用,。
6. 換槍頭,，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照,。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。

具有下列特點(diǎn)：
1.根據(jù) 指標(biāo)的保守序列設(shè)計的專一性引物，與相關(guān)病毒無交叉反應(yīng),。
2.靈敏度比常規(guī) PCR 高 2-3 個數(shù)量級,，可以達(dá)到幾百拷貝/反應(yīng)。
3.即開即用,，用戶只需要提供樣品模板,，操作簡單，定量準(zhǔn)確快速,。
4.一管式熒光定量 PCR 檢測,，避免后續(xù)污染。
5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR,。
6.本產(chǎn)品只適用于科研,，不能用于臨床診斷。
需要自備的器材：
1．儀器：分析天平,、離心機(jī),、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、組織研磨器、-20 ℃冰箱,、可調(diào)移液器（2 µL,、20
µL、200 µL,、1000 µL）,。
2．耗材：熒光 PCR 反應(yīng)管、眼科剪,、眼科鑷,、生理鹽水、1.5 mL 經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管,、吸頭（10 µL,、200 µL、1000 µL）,、滅菌雙蒸水,。

注意事項：
1. 建議使用新鮮采取的動物組織,，若為長期冷凍組織，應(yīng)盡量避免反復(fù)凍融,，否則會導(dǎo)致模板的降解,，影響PCR效率。
2. 試劑Buffer AL若低溫保存,，易產(chǎn)生沉淀,。在使用前務(wù)必將其在室溫中放置一段時間，也可在37℃水浴中預(yù)熱10 min,，以溶解沉淀,，混勻后再使用。
3. 電泳檢測時,，切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否則,，電泳時會在泳道中出現(xiàn)一大團(tuán)拖尾亮帶,，影響實(shí)驗結(jié)果。
4. 建議擴(kuò)增片段長度1 kb以內(nèi),，以便擴(kuò)增效率佳,。
?5. 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗服并佩戴一次性手套操作,。