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熒光假單胞菌探針發(fā)熒光定量PCR試劑盒說明書

產(chǎn)品及特點熒光假單胞菌是一種環(huán)境污染菌,。對于人類是一種罕見的機會致病菌,。可從傷口,、痰,、胸水、尿和血液中分離出來,，也可從血庫存在中分離出,。可在冰箱儲存的血液及血液制品中繁殖,，而且自溶后釋放內(nèi)毒素,。其內(nèi)毒素的磷脂部分，可導(dǎo)致輸血后不可逆的休克,。因此快速靈敏檢測熒光假單胞菌具有重要意義,。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒,，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板,。

2.引物經(jīng)過精心優(yōu)化,，專一性強，只擴增熒光假單胞菌,，與其他微生物沒有交叉反應(yīng),。

3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品,。

4.PCR mix 中含上樣染料,，PCR 后可以直接上樣電泳。

1.本試劑盒足夠做 40μL 體系的 PCR 50 次,，但只能用于科研,。

規(guī)格及成分成分 包裝

2×Probe qPCR MagicMix500μL ）

熒光 PCR 專用模板稀釋液1mL

熒光假單胞菌探針法 qPCR

引物-探針混合液150μL ）

熒光假單胞菌探針法 qPCR 陽性

對照(1×10E7 拷貝/μL)50μL

使用手冊1 份

運輸及保存低溫運輸，-20℃保存,，保存期限為 12 個月,。

自備試劑樣品 DNA。

使用方法一,、稀釋PCR 陽性對照（以 10E1-10E6 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）

如果做定性實驗,，則此步可以跳過。如果做定量實驗,，則需要稀釋陽性對照做標(biāo)準(zhǔn)曲線,。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分,。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,，     只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照,。

1.標(biāo)記 6 個離心管，分別為 6,，5,，4，3,，2,，1。

2.用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭,，下同）,。

3.在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘,，

得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用,。

4.換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用,。

5.換槍頭,，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘,，得 1×10E4 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品,。放冰上待用。二,、樣品 DNA 的制備

7.如果有 N 個樣品,，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照）,，一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）,。可以用 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,，以此作為樣品制備 PC,。另外用水作為樣品制備 NC。

8.用自選方法純化樣品的 DNA,，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容,。三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系,，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析,，并且只做 1 次重復(fù),，則標(biāo)記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板）,，1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管中的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟,，

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù),。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

11.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：

過程溫度時間

預(yù)變性95℃2min

qPCR 反應(yīng)

（40 個循環(huán)）95℃15sec

55℃30sec（采集 FAM 通道的熒光信號）

72℃30sec

四,、數(shù)據(jù)處理

12.如果把本試劑盒用于定量檢測,，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸,，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度,。

13.如果把本試劑盒用于定性檢測,，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40,。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30,。對待測樣品,， 如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性,。如果在 35-40 之間,，

則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性,，如果小于 40,，則為陽性。

 產(chǎn)品CAT#:BH5216-51

低溫運輸,，-20℃保存