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溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒實驗原理
閱讀：508 發(fā)布時間：2022-9-29| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 16.8KB |
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溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒說明書
特點優(yōu)勢：
1. 特異性：所有產(chǎn)品使用的引物均經(jīng)過詳盡的生物信息學分析,，經(jīng)過GenBank及自建龐大數(shù)據(jù)庫的比對，確保所用的每一條引物均為種屬或血清型特異的基因序列區(qū)段,，可實現(xiàn)對細菌種屬及血清型的特異檢測，特異性均達到*,。
2. 重現(xiàn)性：該系列所有產(chǎn)品均經(jīng)過大量實驗菌株的驗證，重現(xiàn)性為*,。
3. 靈敏性：該系列產(chǎn)品可實現(xiàn)對檢測菌的高靈敏檢測,，當樣品中細菌的濃度達到103cfu/ml時,，可實現(xiàn)對其的直接檢測,，無需繁瑣的增菌過程。
4. 實用性：檢測范圍廣,，涵蓋了對人體危害較為嚴重的17種呼吸道及腸道致病菌,，可實現(xiàn)對臨床樣品及其他環(huán)境取樣的快速檢測,，整個檢測過程為3-4個小時。
5. 優(yōu)勢1：序列資源豐富,，除GenBank公布的序列外,，公司還進行了大量菌株的序列破譯,，從理論上保證所選引物具有良好的保守性和特異性。
6. 優(yōu)勢2：該系列試劑盒均經(jīng)過大量的保守性及特異性實驗驗證,，憑借公司擁有的豐富的菌種資源,，每一種檢測試劑盒均經(jīng)過了20余種標準菌株和臨床菌株的保守性驗證及40余種近緣標準菌株和臨床菌株的特異性驗證，確保在使用過程中不會出現(xiàn)任何的假陽性及假陰性報告結(jié)果,。
溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒PCR使用方法：
一、樣品 DNA 的制備
1. 用自選方法純化樣品的 DNA,，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
2. 如果有 N 個樣品,，則需要進行 N+2 個樣品提取,，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管,。如果用本試劑盒自帶的 DNA 釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：
3. 配制溶液 A 工作液,。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個樣品）為例：在一干凈塑料
管中加入 10uL 溶液 A 成分一,，20uL 溶液 A 成分二和 970uL 超純水,，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置,，但最好在一周內(nèi)用完,，不要長期放置,。一次檢測一個樣品需要 100uL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品,。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字,，
配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應的調(diào)整,。
4. 在標記好的 N+2 個離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小,，如奶酪）或5uL 液體樣品（如牛奶）待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5uL 陽性對照,，在樣品制備陰性對照中加入 5uL 水,。
5. 在每個管中加入 100 uL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋,，如果是液體樣品則震蕩混勻,。
6. 95℃保溫 10 分鐘。
7. 待冷卻到常溫后加入 10uL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液,。每個樣品得到的 DNA釋放液足夠進行 50-100 次 PCR,。
溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒實驗規(guī)則：
1、要保證移液槍的準確性,，誤差不能超過2%?？捎盟碗娮犹炱竭M行確定,。但有專業(yè)人員進行矯正。
2,、要配備20ul,、50ul,、100ul、1000ul和排槍各一支,。吸取不同的液體后,，要更換槍頭。即使是吸取標準品時,。
3、要在實驗前1小時將試劑盒從冰箱中取出,，使各種試劑都恢復到室溫,，以使結(jié)果更穩(wěn)定,。
4、實驗時,，要使底物避光保存。
5,、用槍吸取液體時速度不能太快，以免產(chǎn)生氣泡而使吸取量不準確,。
6,、吸取液體時,，要用量程和需要量接近的槍去吸,，減少誤差。
7,、將液體加到酶標孔中時，避免槍頭和孔內(nèi)液體接觸,，可使槍頭上的液滴和孔壁接觸,，液滴會自然流下去,。
8、液體全部加完后,，可將酶標板在桌子上平行輕輕晃動30秒,，混勻液體。也可以用酶標儀的晃動功能,。
9、應盡量做雙孔實驗,，這樣才能保證數(shù)據(jù)的準確性,。
10,、對結(jié)果有疑問的樣品要用其它方法進行確證。
PCR反應流程常規(guī)程序
將PCR反應所需的成分配置完后,，在PCR儀上于94-96℃預加熱幾十秒至幾分鐘,，使模板DNA充分變性,，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中,，先于94℃保持30秒鐘使模板變性,，然后將溫度降到復性溫度（一般50-60℃之間）,，一般保持30秒鐘，使引物與模板充分退火,；在72℃保持1分鐘（擴增1kb片段）,，使引物在模板上延伸,，合成DNA,，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～35次,，使擴增的DNA片段大量累積。最后,，在72℃保持3-7min,，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存,。
2．復性（退火）和延伸溫度
復性的溫度是PCR擴增是否順利的關(guān)鍵因素，通常在50-60℃之間,。具體的溫度主要由引物的Tm值決定,。延伸溫度絕大多數(shù)設(shè)定為72℃,。如果復性的溫度很高，可以將延伸溫度和復性溫度設(shè)置成同一溫度,，變成二步法PCR。
3．反應時間
變性步驟一般使用30秒鐘,，如果模板的G+C含量較高,，或直接用細胞做模板，變性時間可適當延長,。復性時間有30秒種一般是足夠的。延伸時間由擴增產(chǎn)物的大小決定,，一般采用1kb用1分鐘來保證充足的時間,。
4．循環(huán)次數(shù)
循環(huán)次數(shù)主要與模板的起始數(shù)量有關(guān),，在模板拷貝數(shù)為104～105數(shù)量級時，循環(huán)數(shù)通常為25～35次,。
平臺效應（plateaueffect）：PCR擴增過程后期會出現(xiàn)的產(chǎn)物的積累按減弱的指數(shù)速率增長的現(xiàn)象,。原因：底物和引物的濃度已經(jīng)降低，dNTP和DNA聚合酶的穩(wěn)定性或活性降低,，產(chǎn)生的焦磷酸會出現(xiàn)末端產(chǎn)物抑制作用，非特異性產(chǎn)物或引物的二聚體出現(xiàn)非特異性競爭作用,，擴增產(chǎn)物自身復性,，高濃度擴增產(chǎn)物變性不*。
5．PCR反應液的配制
PCR反應體系的配置方式有時也會影響反應的正常進行,。常規(guī)方法與其它酶學反應一樣,，在最后加入DNA聚合酶,。早期的PCR儀沒有帶加熱的蓋子，要求在反應液上覆蓋一層礦物油,，防止水分蒸發(fā),。
對于使用具3’-5’外切活性的高溫DNA聚合酶時,，有時會擴增不出產(chǎn)物。在遇到這個問題時,，如果將反應成分分開配制,，A管含模板,、引物和dNTP，以及調(diào)整體積的H2O,，B管含緩沖液,、DNA聚合酶和水,，然后再將兩管溶液混合起來，可較好地克服這個問題,。
按照常規(guī)的方法配制反應體系,，有時會出現(xiàn)非特異性擴增的問題,。熱啟動（hotstart）PCR操作方式可較好解決這一問題。將dNTP,、緩沖液,，Mg2+和primer先配制好，然后加入一粒蠟珠（如AmpliWaxPCRQam100）,，加熱熔化，再冷卻，使蠟將溶液封住,，最后加入模板和DNA聚合酶等剩余成分,。只有當PCR反應進入高溫階段后,，蠟層熔化，所有反應成分才會混合在一起,。
溫和氣單胞菌PCR檢測試劑盒實驗注意事項：
1）RT-PCR可以檢測組織,、細胞,、血液、細菌等很多材料,，不同的樣本有不同要求,，實驗前請充分溝通確認實驗方案和樣本情況,；
2）客戶盡可能提供實驗的背景信息、物種,、基因準確的名稱和ID號,；
3）客戶盡量不要提供DNA或RNA樣品,。
4）樣本保存于液氮或干冰,，也可以保存于Trizol液中。
實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,，qPCR）是指在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,，*通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法,。實時熒光定量PCR的化學原理包括探針類和非探針類兩類，探針類是利用與靶細胞序列特異性雜交的探針來指示擴增產(chǎn)物的增加,，非探針類是利用熒光染料或者特異性設(shè)計的引物來指示擴增的增加。運用該技術(shù)可以對DNA,、RNA樣品進行定量（包括*定量和相對定量）和定性分析,。
主要服務：DNA或RNA的*定量分析,、基因表達差異分析,、基因分型。
主要技術(shù)：引物設(shè)計,、RNA提取,、cDNA合成,、qPCR。
試劑使用須知：
（1）請參照相關(guān)法規(guī),、文獻、MSDS等信息,，理解并掌握好試劑的特性,，再進行安全操作,。產(chǎn)品僅用于科研
（2）通常購買試劑時一定要想到一次性用完。若估算不足有剩余的話,，更加注意其他保管和管理,。
（3）萬一試劑操作者并非專業(yè)技術(shù)人員,。必須在專業(yè)人士的指導監(jiān)督下進行操作。對于使用后的廢棄物,，不要或者舊的試劑,，應按照相關(guān)法律法規(guī)正當處理。
（4）購買后,，請務必確認標簽上的注意事項；做好預防顛倒,，摔壞的措施和管理體制,；在使用前再次確認標簽上的注意事項,，做好必要的安全對策；對沒有標明其危害特性,、有害特性的,，也要慎重地進行操作,；必須帶好防護用具,，小心翼翼進行操作。