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小鼠苗條素受體（LR/Ob-R）elisa試劑盒實驗原理
閱讀：598 發(fā)布時間：2021-8-13| 提 供 商 | 上海研生實業(yè)有限公司 | 資料大小 | 17KB |
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小鼠苗條素受體(LR/Ob-R)elisa試劑盒說明書
檢測原理
試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）,。往預先包被人鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）捕獲抗體的包被微孔中,，依次加入標本,、標準品,、HRP標記的檢測抗體,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色,，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色,。顏色的深淺和樣品中的人鈣衛(wèi)蛋白（Calprotectin）呈正相關(guān),。用酶標儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計算樣品濃度,。
樣品收集,、處理及保存方法
1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細胞刺激,，收集血液后,，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細胞迅速小心地分離。
2. 血漿：EDTA,、檸檬酸鹽或肝素抗凝,。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清,。
3. 細胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。
4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎,。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清,。
5. 保存：如果樣本收集后不及時檢測,，請按一次用量分裝,，凍存于-20℃，避免反復凍融,，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。
自備物品
1. 酶標儀（450nm）
2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL,、2-20uL,、20-200uL、200-1000uL
3. 37℃恒溫箱
操作注意事項
1. 試劑盒保存在2-8℃,，使用前室溫平衡20分鐘,。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象,，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
2. 實驗中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中,，密封（低溫干燥）保存,。
3. 標準品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預處理后的樣本無需稀釋,，直接取10μL加樣即可,。
4. 嚴格按照說明書中標明的時間、加液量及順序進行溫育操作,。
5. 所有液體組分使用前充分搖勻。
試劑盒組成
名稱96孔配置48孔配置備注
微孔酶標板12孔×8條12孔×4條無
標準品（120μg/g）0.6mL0.6mL按說明書進行稀釋
標準品稀釋液6mL3mL無
樣本稀釋液6mL3mL無
檢測抗體-HRP10mL5mL無
20×洗滌緩沖液25mL15mL按說明書進行稀釋
底物A6mL3mL無
底物B6mL3mL無
終止液6mL3mL無
封板膜2張2張無
說明書1份1份無
自封袋1個1個無
注：標準品用標準品稀釋液依次稀釋為：120,、60、30,、15、7.5,、3.75 μg/g
試劑的準備
20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水,。
洗板方法
1. 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體,，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體,，在吸水紙上拍干,，如此洗板5次,。
2. 自動洗板機：每孔注入洗液350μL,，浸泡1min，洗板5次,。
操作步驟
1. 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
2. 設(shè)置標準品孔和樣本孔,，標準品孔各加不同濃度的標準品50μL,；
3. 待測樣本孔先加待測樣本10μL，再加樣本稀釋液40μL,；
4. 隨后標準品孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的檢測抗體100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。
5. 棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復洗板5次（也可用洗板機洗板）,。
6. 每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光孵育15min,。
7. 每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長處測定各孔的OD值,。
結(jié)果判斷
繪制標準曲線：在Excel工作表中，以標準品濃度作橫坐標,，對應(yīng)OD值作縱坐標,，繪制出標準品線性回歸曲線，按曲線方程計算各樣本濃度值,。
試劑盒性能
1. 準確性：標準品線性回歸與預期濃度相關(guān)系數(shù)R值,，大于等于0.9900。
2. 靈敏度：低檢測濃度小于1.0μg/g,。
3. 特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。
4. 重復性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%。
5. 貯藏：2-8℃,，避光防潮保存,。
6. 有效期：6個月
免責聲明
1. 試劑盒僅供研究使用，不得用于臨床實驗或人體實驗,，否則所產(chǎn)生的一切后果,，由實驗者承擔，本公司概不負責,。
2. 嚴格按照說明書操作,，實驗者違反說明書操作，后果由實驗者承擔,。