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文氏密螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒使用流程

閱讀:1163          發(fā)布時間:2020-11-25

文氏密螺旋體探針法熒光定量PCR試劑盒使用流程:

一,、稀釋PCR陽性對照(以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)

1. 注意:由于標準品濃度非常高,,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分),。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,,本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照,只提供可以直接使用的DNA段作為陽性對照,。

2. 標記6個離心管,,分別為7,,6,5,,4,,3,2,。

3. 用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR模板稀釋液(用帶芯槍頭,,下同)。

4. 在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照,,充分震蕩1分鐘,,得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。

5. 換槍頭,在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),,充分震蕩1分鐘,,得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用,。

6. 換槍頭,,在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中,充分震蕩1分鐘,,得1×10E5拷貝/μL的陽性對照,。放冰上待用。

7. 重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照,。放冰上待用,。

二、樣品DNA的制備

8. 如果有N個樣品,,必須設置N+2個提取,,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照),??梢杂?0μL上步制備的PCR陽性對照的第4號(濃度為1×10E4 拷貝/μL,10μL相當于1萬拷貝)或第5號(濃度為1×10E5 拷貝/μL,,10μL相當于10萬拷貝)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,,以此作為PC。另外用水作為NC,。如果每次制備需要200μL樣品,,則PC和NC的體積也必須是200μL。

9. 用自選方法純化樣品的DNA,,本試劑盒跟市場上大多數(shù)病毒DNA提取試劑盒兼容,。

三,、設置qPCR反應(20 μL體系,在樣品制備室進行)

10. 如果只做1次重復,,則標記N+9個PCR管,,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照,,6個用于PCR陽性對照,。如果做2-3次重復,則反應設置數(shù)量相應增加2或3倍,。

11. 產(chǎn)品僅用于科研在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復,。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后加)

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