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新孢子蟲（Ne）核酸檢測試劑反應(yīng)五要素：

參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即引物,、酶、dNTP,、模板和Mg2+

引物：引物是PCR特異性反應(yīng)的關(guān)鍵,，PCR 產(chǎn)物的特異性取決于引物與模板DNA互補的程度。理論上,，只要知道任何一段模板DNA序列,， 就能按其設(shè)計互補的寡核苷酸鏈做引物，利用PCR就可將模板DNA在體外大量擴增,。設(shè)計引物應(yīng)遵循以下原則：

①引物長度： 15-30bp,，常用為20bp左右。

②引物擴增跨度： 以200-500bp為宜,，特定條件下可擴增長至10kb的片段,。

③引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴增效果不佳,，G+C過多易出現(xiàn)非特異條帶,。ATGC*隨機分布，避免5個以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列,。

④避免引物內(nèi)部出現(xiàn)二級結(jié)構(gòu),，避免兩條引物間互補，特別是3'端的互補,，否則會形成引物二聚體,，產(chǎn)生非特異的擴增條帶。

⑤引物3'端的堿基,，特別是末及倒數(shù)第二個堿基,，應(yīng)嚴(yán)格要求配對,，以避免因末端堿基不配對而導(dǎo)致PCR失敗。

⑥引物中有或能加上合適的酶切位點,， 被擴增的靶序列*有適宜的酶切位點,， 這對酶切分析或分子克隆很有好處。

⑦引物的特異性：引物應(yīng)與核酸序列數(shù)據(jù)庫的其它序列無明顯同源性,。

引物量：每條引物的濃度0.1～1umol或10～100pmol,，以*引物量產(chǎn)生所需要的結(jié)果為好，引物濃度偏高會引起錯配和非特異性擴增,，且可增加引物之間形成二聚體的機會,。