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怎樣用酶標(biāo)儀檢測氟喹諾酮
一,、概要：
氟喹諾酮類（FQNS）又稱吡酮酸類或吡啶酮酸類，是一類十分重要的廣譜抗生素藥物，能抑制細(xì)菌DNA螺旋酶。其常在牛、豬和雞等家禽養(yǎng)殖中被作為獸藥使用,。特別是雞、豬和魚/蝦等的養(yǎng)殖企業(yè)均使用其來防治家禽傳染病已成為獸醫(yī)臨診和水產(chǎn)養(yǎng)殖中重要的抗感染藥物之一,，由于其耐藥性和潛在的致癌性引起廣泛的關(guān)注,。歐盟理事會條例中對部分氟喹諾酮類藥物的大*值MRL作出了明確的規(guī)定。
二,、試驗原理
采用間接競爭ELISA方法,，在酶標(biāo)板微孔條上預(yù)包被氟喹諾酮類抗原，樣品中殘留的氟喹諾酮類藥物和微孔條上預(yù)包被的抗原競爭抗氟喹諾酮類抗體,，加入酶標(biāo)二抗后,，經(jīng)TMB底物顯色，樣品的吸光值與其殘留物氟喹諾酮類藥物的含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較再乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù),，即可得出樣品中殘留物氟喹諾酮類藥物的含量。
三,、使用范圍：
可定性,、定量檢測肌肉、肝臟,、牛奶,、奶粉等樣品中氟喹諾酮類藥物的殘留量。
四,、使用設(shè)備及試劑
……酶標(biāo)儀 450nm/630nm
……離心機
……均質(zhì)器
……氮吹儀或旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器
……洗耳球
……聚苯乙烯離心管：10mL,、50mL
……微量移液器20μL～200μL，100μL～1000μL
……刻度移液管
……天平：感量0.01g
試劑：
……甲醇 （分析純）
……二氯甲烷 （分析純）
……正己烷（分析純）
……濃鹽酸
……十二水磷酸氫二鈉（分析純）
……二水磷酸二氫鈉（分析純）
五,、檢測步驟：
測定前應(yīng)須知：
1,、使用之前將所有試劑和需用板條的溫度回升至室溫（20～25℃）。
2,、使用之后立即將所有試劑放回2～8℃,。
3、在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性,，正確的洗板操作是ELISA測定程序中的要點。
4,、在所有恒溫孵育過程中,，避免光線照射，用蓋板膜封住微孔板,。
操作步驟：
1,、將所需試劑從冷藏環(huán)境中取出，置于室溫（20～25℃）回溫30min以上,，注意每種液體試劑使用前均需輕輕搖勻,。
2、取出所需數(shù)量的微孔板,，將不用的微孔放入帶有干燥劑的錫箔袋中,，保存于2～8℃。
3,、洗滌工作液在使用前也需回溫,。
4、編號：將樣品和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行,，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣品孔所在的位置。
5,、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品：加標(biāo)準(zhǔn)品/樣品50ul/孔到對應(yīng)的微孔中,，然后加入抗試劑50ul/孔，輕輕振蕩混勻,，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min,。
6、洗板：小心揭開蓋板膜,，將孔內(nèi)液體甩干,，用洗滌工作液250ul/孔，充分洗滌4～5次,，每次間隔10～20s,，用吸水紙拍干（拍干后若有氣泡可用未使用過的槍頭戳破）。
7,、加酶標(biāo)物：加入酶標(biāo)物100ul/孔,，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)15min,，取出重復(fù)洗板步驟6,。
8、顯色：加入底物液A液50ul/孔,，再加底物液B液50ul/孔,，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板后置25℃避光環(huán)境中反應(yīng)10～15min。（如顏色較淺可適當(dāng)延長此步的反應(yīng)時間）
9,、測定：加入終止液50ul/孔,，輕輕振蕩混勻，設(shè)定酶標(biāo)儀于450nm處（建議用雙波長450/630nm檢測,，請在5min內(nèi)讀完數(shù)據(jù)）,，測定每孔OD值。