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產品簡介
羊源性成分探針法熒光定量PCR檢測試劑盒是即用型PCR試劑盒的改良產品， 含有Taq DNA 聚合酶,、dNTPs,、MgCl2、反應緩沖液、PCR 增強劑,、上樣染料等所有PCR 所需要的成分,，用戶只需加入模板和引物即可進行PCR 反應，具有廣泛的用途,。
詳細介紹
需要自備的器材：
1．儀器：分析天平,、離心機、熒光 PCR 擴增儀,、組織研磨器,、-20 ℃冰箱、可調移液器（2 µL,、20µL,、200 µL、1000 µL）,。
2．耗材：熒光 PCR 反應管,、眼科剪、眼科鑷,、生理鹽水,、1.5 mL 經焦碳酸二乙酯（DEPC）水
處理的滅菌離心管、吸頭（10 µL,、200 µL,、1000 µL）、滅菌雙蒸水,。
具有下列特點：
1.產品僅用于科研即開即用,，用戶只需要提供樣品 DNA 模板，操作簡單,，定量準確快速,。
2. 引物經過優(yōu)化，特異性強,。預期的 PCR 產物長度為 560 bp,。
3. PCR mix 中含上樣染料，PCR 后可以直接上樣電泳,。
4. 提供陽性對照,，便于分析試驗結果。
產品名稱 | |
英文名稱 | 詳見說明書 |
貨號 | CP934962 |
產品特征:
羊源性成分探針法熒光定量PCR檢測試劑盒靈敏度高：能對低拷貝或多樣性模板進行定量,。
特異性強：采用熱啟動酶的激活機制,，抑制非特異性擴增 。
重復性好：擴增曲線重合度高,，受干擾影響少,。
擴增效率高：擴增曲線Ct值低,，起峰快，效率高,。
原理:
所謂實時熒光定量PCR技術,，是指在PCR反應體系中加入熒光基團,，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程,，后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。
檢測方法：
1.Ⅰ法：
在PCR反應體系中,，加入過量SYBR熒光染料,，SYBR熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號,，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號,，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加*同步。
定量PCR擴增熒光曲線圖
PCR產物熔解曲線圖
2.TaqMan探針法：
探針完整時,，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,；PCR擴增時，Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,，產品僅用于科研使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離,，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈,，就有一個熒光分子形成,，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產物的形成*同步。
熒光定量PCR實驗步驟：
①取凍存已裂解的細胞,，室溫放置5分鐘使其*溶解,。
②兩相分離 每1ml的TRIZOL試劑裂解的樣品中加入0.2ml的lvfang，蓋緊管蓋,。手動劇烈振蕩管體15秒后,，15到30℃孵育2到3分鐘。4℃下12000rpm離心15分鐘,。離心后混合液體將分為下層的紅色酚lvfang相,，中間層以及無色水相上層。RNA全部被分配于水相中,。水相上層的體積大約是勻漿時加入的TRIZOL試劑的60%,。
③RNA沉淀 將水相上層轉移到一干凈無RNA酶的離心管中。加等體積異丙醇混合以沉淀其中的RNA,，混勻后15到30℃孵育10分鐘后,，于4℃下12000rpm 離心10分鐘。此時離心前不可見的RNA沉淀將在管底部和側壁上形成膠狀沉淀塊,。
④RNA清洗 移去上清液,，每1mlTRIZOL試劑裂解的樣品中加入至少1ml的75%乙醇(75%乙醇用DEPCH2O配制),，清洗RNA沉淀?；靹蚝?，4℃下7000rpm離心5分鐘。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液,，使RNA沉淀在室溫空氣中干燥5-10分鐘,。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA時，先加入無RNA酶的水40μl用槍反復吹打幾次,，使其*溶解,，獲得的RNA溶液保存于-80℃待用。 1)紫外吸收法測定先用稀釋用的TE溶液將分光光度計調零,。然后取少量RNA溶液用TE稀釋(1:100)后,，讀取其在分光光度計260nm和280nm處的吸收值，測定RNA溶液 濃度和純度,。
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