冷凍保存細(xì)胞之方法:
冷凍保存方法一: 冷凍管置于4℃ 30~60 分鐘→ （-20 ℃30 分鐘*） → -80 ℃16~18 小時(shí)（或隔夜） → 液氮槽vaporphase 長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。
冷凍保存方法二: 冷凍管置于已設(shè)定程序之可程序降溫機(jī)中每分鐘降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下， 再放入液氮槽vapor phase長(zhǎng)期儲(chǔ)存,。*-20 ℃不可超過1 小時(shí),， 以防止冰晶過大，造成細(xì)胞大量死亡,，亦可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中,，惟存活率稍微降低一些。

腦組織是指包容在顱腔內(nèi)的三大塊神經(jīng)纖維組織：大腦,、腦干和小腦,。公司科技提供來自新鮮或冷凍大鼠腦動(dòng)脈血管組織中高質(zhì)量的總RNA,，PCR準(zhǔn)備的條cDNA鏈，蛋白質(zhì)及其亞組分,。所有的產(chǎn)品在發(fā)貨之前均經(jīng)過嚴(yán)格的QA/QC流程以確保其質(zhì)量,。這些產(chǎn)品可以直接用于基因克隆，表達(dá)圖譜分析以及各種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)的研究,。
總RNA制備：利用Qiagen RNeasy Kit的Trizol試劑分離RNA,，然后用Qiagen RNA Clean Kit進(jìn)行純化。公司提供的總RNA樣品附有RNA樣品總濃度,、總含量,、電泳照片、OD值測(cè)定結(jié)果等,。

cDNA制備：純化后的總RNA來合成cDNA鏈,，以50ul總反應(yīng)體系進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，體系中包括MMLV反轉(zhuǎn)錄酶和隨機(jī)引物以及10mg總RNA,。68℃反應(yīng)10min 后終止RT反應(yīng),。利用1x RT Buffer 運(yùn)輸cDNA，1 ul cDNA 足夠做一次PCR反應(yīng),。所有cDNA產(chǎn)品在訂單發(fā)貨之前都經(jīng)過了嚴(yán)格的QA/QC分析，保證了產(chǎn)品的質(zhì)量,。

蛋白制備：利用改良型RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin)制備大鼠腦動(dòng)脈血管組織裂解液,，離心去除組織碎片，通過Bio-Rad蛋白檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白濃度,，組織蛋白稀釋后用非還原蛋白Buffer (50 mM Tris-HCl, pH 6.8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0.002% Bromphenol Blue)添加5%β-巰基乙醇及PMSF,，-80度保存。

潛在的應(yīng)用： <1>已知基因的PCR克??；<2>mRNA選擇性剪接；<3>基因克隆與目標(biāo)測(cè)序,；<4> Western and Northern Blot,；<5>蛋白檢測(cè)與蛋白質(zhì)組學(xué)；<6>芯片研究與表達(dá)圖譜,。

細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍,，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘,，棄去上清液,，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜,。第二天換液并檢查細(xì)胞密度,。
2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%,，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
對(duì)于懸浮細(xì)胞,，傳代可參考以下方法：
方法一：收集細(xì)胞,，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘,，棄去上清液,，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
方法二：可選擇半數(shù)換液方式,，棄去半數(shù)培養(yǎng)基后，將剩余細(xì)胞懸起,，將細(xì)胞懸液按1：2到1：3的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中,。
3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存,。懸浮細(xì)胞凍存時(shí),，應(yīng)將細(xì)胞收集，1000RPM,，常溫條件下離心5分鐘,，少量保存上清液（防止細(xì)胞吸走），加入部分新鮮培養(yǎng)基,，吹打均勻后,，加入到凍存管中，在凍存管中加入10%DMSO搖勻后進(jìn)行凍存,。凍存培養(yǎng)基
凍存細(xì)胞時(shí)必須使用推薦的凍存培養(yǎng)基,。凍存培養(yǎng)基中應(yīng)含有 DMSO 或者甘油等冷凍保護(hù)劑。還可使用專門配制的*凍存培養(yǎng)基,。
1）細(xì)胞凍存培養(yǎng)基是一種用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞的即用型*凍存培養(yǎng)基,，其所含胎牛血清和牛血清比例經(jīng)過優(yōu)化，可改善細(xì)胞活力以及解凍后的細(xì)胞復(fù)蘇效果,。 
2）凍存培養(yǎng)基是一種化學(xué)成分確定的,、無蛋白、無菌凍存培養(yǎng)基,，含10% DMSO,，適用于多種干細(xì)胞和原代細(xì)胞 (黑色素細(xì)胞除外) 的凍存。
操作流程：
1.1主要試劑與儀器：倒置相差顯微鏡（日本 olympus imt-413）,，co2孵箱（日本yamato it-61）,。
1.2 hek-293細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng)傳代及凍存：
1.2.1 細(xì)胞的復(fù)蘇培養(yǎng) 從液氮罐中取出凍存管,立即投入37℃水浴,并不斷的搖動(dòng),使之迅速融化。 將溶解的細(xì)胞凍存管取出,用酒精消毒后打開,吸出溶有細(xì)胞的凍存液,加入事先裝好培養(yǎng)液（37℃預(yù)熱,，8～10倍體積）離心管內(nèi),稍微吹打混勻,然后1000rpm 5min,去除上清,加入適量培養(yǎng)液,吹打成細(xì)胞懸液, 以1×105/ml密度接種于25cm2培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),，在37℃,、5％co2及飽和濕度下培養(yǎng)。
1.2.2 細(xì)胞傳代 原代培養(yǎng)的hek－293細(xì)胞48h換液1次,，細(xì)胞長(zhǎng)至60%～70%融合時(shí),，用0.25%胰酶消化1～2min，將培養(yǎng)瓶再用手掌輕輕敲打使細(xì)胞脫壁,、懸浮,、分散，為使細(xì)胞進(jìn)一步分散可用吹打管輕輕吹打幾次,，獲得細(xì)胞懸液,，然后加入倍量的培養(yǎng)基，溫和混勻,，吸管分裝混合液,，傳代擴(kuò)增細(xì)胞。
1.3 細(xì)胞形態(tài)的觀察 在倒置顯微鏡下觀察并記錄細(xì)胞的生長(zhǎng)情況及形態(tài)特征,。
1.4 細(xì)胞的計(jì)數(shù) 常規(guī)消化細(xì)胞,，待細(xì)胞變圓、脫壁并浮起,，加入少量培養(yǎng)基離心,，再用pbs重懸并吹打制成細(xì)胞懸液。在細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋玻片的一側(cè)加微量細(xì)胞懸液,，用10×物鏡觀察計(jì)數(shù)板四角大方格細(xì)胞數(shù),，按公式計(jì)算出細(xì)胞數(shù)。細(xì)胞數(shù)/ml原液＝(四方格細(xì)胞數(shù)之和/4) ×104,。
1.5 細(xì)胞的貼壁率 指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，以0.25％胰酶消化成單細(xì)胞懸液,，計(jì)數(shù)后分別接種于12個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中,，每?jī)尚r(shí)隨機(jī)取出3瓶細(xì)胞，吸除培養(yǎng)基及未貼壁細(xì)胞,，加入胰消化酶消化,、計(jì)數(shù)已貼壁細(xì)胞，取其平均值,，按照公式：貼壁率(%)=(已貼壁細(xì)胞數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)) ×100％,，計(jì)算貼壁率。 
1.6 生長(zhǎng)曲線 取指數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用胰酶消化制成單細(xì)胞懸液,，以1×104/孔接種于24孔板,，每孔加入1ml培養(yǎng)基。每天隨機(jī)取3孔,，計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞的數(shù)目并計(jì)算平均值,。連續(xù)計(jì)數(shù)10d,，繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

以下是的相關(guān)產(chǎn)品：

MTT 噻唑藍(lán)  AmrescoCD5分子樣蛋白檢測(cè)試盒

MTT 噻唑藍(lán)  AmrescoCD5分子檢測(cè)試盒

TTC 2,3,5氯化三苯基四唑  AmrescoCD4分子檢測(cè)試盒

TTC 2,3,5氯化三苯基四唑  AmrescoCD45分子檢測(cè)試盒

TTC 2,3,5氯化三苯基四唑  AmrescoCD44分子檢測(cè)試盒

S-adenosyl-L-methionine(SAM) S-腺苷-L-蛋氨CD44變體6檢測(cè)試盒

PMS 吩嗪脂CD3分子檢測(cè)試盒

TAPS 三羥基胺基磺CD34分子檢測(cè)試盒

Potassium gluconate 葡萄糖鉀CD30分子檢測(cè)試盒

D-Gluconic acid calcium D-葡萄糖鈣CD22分子檢測(cè)試盒
大鼠腦動(dòng)脈血管組織提取物人γ干擾素誘導(dǎo)蛋白16elisa試盒二基錫(標(biāo)準(zhǔn)品)

人γ干擾素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子elisa試盒基內(nèi)吸(標(biāo)準(zhǔn)品)

人S100鈣結(jié)合蛋白A8elisa試盒2,4'-滴滴(標(biāo)準(zhǔn)品)

人Rho家族GTP酶1elisa試盒2,4′-DDT標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/mL,基體：辛)

人L選擇素elisa試盒4,4'-滴滴(標(biāo)準(zhǔn)品)

人L苯氨解氨酶elisa試盒菊酯(標(biāo)準(zhǔn)品)

人1,3-βD葡葡糖苷酶elisa試盒菊酯標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,基體：石油醚)

人抗α干擾素抗體elisa試盒草萘胺(標(biāo)準(zhǔn)品)

人抗Q熱抗體elisa試盒除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(100μg/ml,u=2%,，基體：)

人可溶性脂酶A2elisa試盒除蟲脲標(biāo)準(zhǔn)溶液(10μg/ml,u=3%)

人可溶性P選擇素elisa試盒2,，4-滴(標(biāo)準(zhǔn)品)

人維生素Aelisa試盒2，4-滴(98%)

人活化凝因子Ⅻelisa試盒二噻農(nóng)(標(biāo)準(zhǔn)品)

人活化蛋白Celisa試盒棉隆(標(biāo)準(zhǔn)品)

人活化蛋白C抵抗素elisa試盒雙氯酚(標(biāo)準(zhǔn)品)

實(shí)驗(yàn)報(bào)告：
一,、分離與培養(yǎng)：
1,、無菌條件下，取出1-3d 齡SD大鼠心房組織,，然后用PBS將此組織塊清洗2次,，后將組織剪成1mm3左右大小,；
2,、往組織塊中加入4 mL酶消化液（0.1% 胰酶和0.1% I型膠原酶），混懸10s,，置37℃條件下消化10min,，之后用滴管吹打制成單細(xì)胞懸液，自然沉淀并收集上清,，用含10% FBS培養(yǎng)基終止消化后4℃放置,；
3、剩下的組織再加入3～4mL酶消化液,，混懸10s,，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并終止消化后4℃放置,，重復(fù)此步驟2-3次,，直至組織*被消化；
4,、用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾細(xì)胞消化液,，1200r/min 離心10min，棄去上清,，沉淀細(xì)胞用含有10％ FBS DMEM/F12培養(yǎng)基混懸,，接種于25cm2培養(yǎng)瓶，放置于37℃ ,，5％CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng),；
5、差速貼壁1h后,，吸出培養(yǎng)基,，按實(shí)驗(yàn)需要接種于6孔板中繼續(xù)培養(yǎng)；
二,、免疫熒光鑒定：
1,、待心房肌細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),，棄去培養(yǎng)基，用溫育的PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min,，然后用4%多聚甲醛在室溫條件下固定細(xì)胞15min；
2,、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min，然后在4℃條件下,，用0.1％Triton X-100透膜15min,；
3、PBS沖洗細(xì)胞2次,，每次10min,，然后在室溫條件下，用4% BSA封閉細(xì)胞30min,；
4,、按1: 100的比例稀釋α-actin一抗，然后將其放在4℃冰箱中孵育細(xì)胞過夜,；
5,、PBS沖洗細(xì)胞3次，每次10min,，按1：150的比例稀釋抗α-actin的二抗,， 37℃條件下放置1h；
6,、用PBS沖洗3次,，每次10min，后在倒置熒光顯微鏡下觀察圖像并拍照,。